عنوان

صفحه چکیده

1 فصل اول: کلیات تحقیق مقدمه  

2 فصل دوم: ی بر تحقیقات گذشته ٢ـ١ـ اشریشیا کلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC)

4 ٢ـ٢ـ   فاکتور های بیماری زای تولید شده توسط UPEC

5 ٢ـ٢ـ١ـ   ادهسین ها و فاکتور های موثر در کلونیزاسیون

5 ١_٢_٢_١_   پیلی یا فیمبریه (Fimbriae)

5 ٢_٢_٢_١_ فیمبریه نوع

6 ٣_٢_٢_١_ فیمبریه P  

7 ٤_٢_٢_١_ فیمبریه S  

8 ٥_٢_٢_١_   تاژک و تحرک

9 ٦_٢_٢_١_   Curli

10 ٧_٢_٢_١_  پیلی F جنسی

11 ٢ـ٢ـ٢ـ توکسین ها

11 ١_٢_٢_٢_ آلفا همولیزین

12 ٢_٢_٢_٢_ فاکتور نکروز دهنده سیتوتوکسیک (CNF_1)

12 ٢ـ٢ـ٣ـ   بقاء و فرار از سیستم ایمنی

12 ١_٢_٢_٣_ سیدروفور ها (آئروباکتین)

12 ٢_٢_٢_٣_ کپسول پلی ساکاریدی

13 ٣_٢_٢_٣_ تشکیل بیوفیلم

14 ٢ـ٣ـ   عفونت های مجاری ادراری( Urinary Tract Infection; UTI)

14 ٢ـ٣ـ١ـ نقش پیلی در عفونت های مجاری ادراری

16 ٢ـ٤ـ بیوفیلم ها

17 ٢ـ٤ـ١ـ توسعه بیوفیلم

18 ٢ـ٤ـ٢ـ مقاومت آنتی بیوتیکی در بیوفیلم ها

20 ٢ـ٤ـ٣ـ بررسی ارتباط بین تشکیل بیوفیلم، فاکتورهای یوروویرولان و مقاومت ضد میکروبی

22 ٢ـ٥ـ نقش آب گریزی (Hydrophobicity) در اتصال باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن

23 فصل سوم : مواد و روش ها ٣ـ١ـ   مواد و وسایل

24 ٣ـ١ـ١ـ محیط های کشت استفاده شده

24 ٣ـ١ـ٢ـ مواد شیمیایی

24 ٣ـ١ـ٣ـ کیت ها

24 ٣ـ١ـ٤ـ دستگاه ها

24 ٣ـ٢ـ   جمع آوری نمونه ها

25 ٣ـ٣ـ جداسازی و خالص سازی

25 ٣ـ٤ـ مشاهده میکروسکوپی

25 ٣ـ٥ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتریUPEC

26 ٣ـ٦ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

26 ٣ـ٧ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گرفتن از هیدروکربن اکتان

26 ٣ـ٨ـ استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت استخراج DNA شرکت سینا ژن

28 ٣ـ٩ـ تعیین کیفیت DNA با بهره گرفتن از الکتروفورز بر روی ژل آگاروز

28 ٣ـ١٠ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

29 ٣_١١_ الکتروفورز ژل آگارز

31 فصل چهارم: نتایج ٤ـ١ـ آزمایشات تشخیصی برای تعیین اشریشیا کلی یوروپاتوژن (UPEC)

33 ٤ـ٢ـ فراوانی باکتریهای بیماریزای جدا شده از ادرار

34 ٤ـ٣ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC

34 ٤ـ٤ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

36 ٤ـ٥ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گرفتن از هیدروکربن اکتان

38 ٤ـ٦ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

40  فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری ٥ـ١ـ بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری UPEC

52 ٥ـ٢ـ بررسی تشکیل بیوفیلم UPEC با روش میکروتیتر پلیت

44 ٥ـ٣ـ بررسی هیدروفوبیسیتی UPEC با بهره گرفتن از هیدروکربن اکتان

45 ٥ـ٤ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR)

46 نتیجه گیری

48 پیشنهادات

49 منابع و مآخذ

50 چکیده انگلیسی

57  

  چکیده

عفونت دستگاه ادراری یکی از شایعترین عفونت های بیمارستانی است که از کلونیزه شدن اشرشیا کلی یوروپاتوژن در اپیتلیوم مخاطی میزبان ناشی می شود و به بافت میزبان آسیب می رساند. ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی یوروپاتوژن دخیل هستند. از جمله فاکتورهای سطحی در اتصال باکتری و تشکیل بیوفیلم، پیلی P و S می باشد. هدف از این مطالعه تعیین میزان مقاومت آنتی بیوتیکی ، بررسی تشکیل بیوفیلم اشریشیا کلی یوروپاتوژن، سنجش قدرت اتصالی یا خاصیت هیدروفوبیسیتی آن و بررسی وجود ژن های فیمبریه ای pap وsfa و ارتباط آنها در تشکیل بیوفیلم بود.

در این تحقیق تعداد 100 نمونه از کشت باکتری بیماران مشکوک به عفونت دستگاه ادراری (UTI) جمع آوری گردید. با بهره گرفتن از تست های بیوشیمیایی متداول E.coli بودن 70 نمونه تایید گردید. مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری اشریشیا کلی یوروپاتوژن با بهره گرفتن از روش Kirby – Bauer مورد بررسی قرار گرفت. تشکیل بیوفیلم این باکتری با روش میکروتیترپلیت بررسی شد. به منظور بررسی اتصال باکتری و میزان هیدروفوبیسیتی ، روش هیدروکربن اکتان استفاده شد. پس از استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت استخراج، حضور ژن های pap و sfa به روش Multiplex PCR مورد بررسی گرفت.

از مجموع 100 نمونه مورد بررسی به کمک روش های بیوشیمیایی متداول 70 نمونه به عنوان اشریشیا کلی یوروپاتوژن شناسایی شدند. نتایج نشان دادن که این باکتری با هیدروفوبیسیتی 23% توانایی تشکیل بیوفیلم را دارد. از نظرمیزان تشکیل بیوفیلم 86% قدرت بسیار کم، ٨/٢ ٪ قدرت متوسط و ٢/١١٪ دارای قدرت بسیار بالا نشان دادند. همچنین بر اساس نتایج بدست آمده از آزمایش Multiplex PCR بر روی 10 نمونه ای که بالاترین قدرت تشکیل بیوفیلم را داشتند، 10نمونه (100٪) واجد ژن pap، 7 نمونه (70٪) واجد ژن sfa و 7 نمونه (70٪) نیز به طور همزمان دارای ژن pap و sfa بودند.

نتایج این مطالعه نشان داد که ژن های pap و sfa شایعترین ژن های کد کننده پیلی در اشریشیا کلی های جدا شده از عفونت ادراری هستند که می توانند به اتصال این باکتری به بافت های میزبانی و تشکیل بیوفیلم های مقاوم به آنتی بیوتیک کمک کنند.

واژه های کلیدی: عفونت­های دستگاه ادراری، اشریشیا کلی یوروپاتوژن، تشکیل بیوفیلم، Multiplex PCR

مقدمه:

اشریشیا کلی بیشترین گونه باسیل گرم منفی شایع در فلور مدفوعی است. این باکتری یک گونه فوق العاده متنوع است که توانایی کلونیزه شدن و پایداری در نیچ های بیشماری در میزبان های حیوانی، انسانی و محیط را دارد. بعضی از سویه های اشرشیا کلی می توانند از سویه های کامنسال خودشان متمایز شوند، بیماریزایی طبیعی بیشتر و توانایی ایجاد بیماریهای جدی تر در دستگاه گوارش، بافت ها و اندام های دیگر میزبان ایجاد کنند. این سویه های پاتوژن به طور گسترده به عنوان اشرشیا کلی اسهال زا یا اشرشیا کلی پاتوژن خارج روده ای Extra-intestinal Pathogenic E.coli;ExPEC ) ) طبقه بندی می شوند. از میان ExPEC ها، سویه های اشرشیاکلی یوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC)با بیماریزایی انسانی در ارتباط است. سویه های UPEC به عنوان فرصت طلب داخل سلولی عمل می کنند و با توجه به حساسیت و رفتار میزبان و توسط به کارگیری فاکتورهای ویرولان مختلف برای کلونیزه شدن در دستگاه ادراری برتری کسب می کنند. ( Johnson et al. 1998; Johnson. 2002; Marrs et al. 2005)

UPEC در مجاری ادراری می تواند در مثانه کلونیزه شود و ایجاد التهاب مثانه (Cystitis) کند و همچنین می تواند از طریق حالب به کلیه ها صعود کرده و باعث ایجاد پیلونفریت (Pyelonephritis) شود. مولکول و ساختارهای مختلف سطح سلولی در تشکیل بیوفیلم در اشرشیاکلی­ یوروپاتوژن دخیل هستند (Marrs et al,2005)

بیوفیلم ها مجموعه ای از سلول های میکروبی هستند که به طور برگشت ناپذیر به سطح وابسته اند و به وسیله شستشو ملایم از بین نمی روند. علاوه بر این، تمایز سلول های غیر متصل (Planctonic) به شکل بیوفیلم بالغ، تغییرات فنوتیپی را ایجاد می کند که دارای پیامد های عمده ای از قبیل افزایش مقاومت به عوامل ضد میکروبی و ازبین نرفتن توسط دفاع میزبان است. این تغییرات فنوتیپی باعث تغییر سلول های اشرشیا کلی از حالت غیر متصل (Planctonic) به حالت متصل می شود.(Hanna. 2003)

بیش از 50% همه عفونت های باکتریایی گزارش شده شامل تشکیل بیوفیلم اند. رشد بیوفیلم باکتریهای پاتوژن اغلب منجر به عفونت هایی می شود که تحمل به آنتی بیوتیک ها و پاسخ های ایمنی میزبان را افزایش می دهد ( Lane et al.2007).

عفونت های دستگاه ادراری ( Urinary Tract Infection ) یکی از شایعترین عفونت های بیمارستانی است که از کلونیزه شدن اشرشیا کلی یوروپاتوژن در اپیتلیوم مخاطی میزبان ناشی می شود و به بافت میزبان آسیب می رساند. UPEC مسئول ایجاد 80% همه عفونت های دستگاه ادراری علامت دار (UTI) و باکتریوریا بدون علامت(Asymptomatic Bacteriuria; ABU) است تقریبا بیشتر از 90% افراد جامعه به آن مبتلا می شوند (Ronald. 2002;Ulett et al. 2007).

تواناییUPEC برای متصل شدن به بافت های میزبان یکی از فاکتورهای برتری است که کلونیزاسیون UPEC را در دستگاه ادراری تسهیل می کند. چندین فاکتور سطحی در تشکیل بیوفیلم دخیل هستند مانند: تاژک، پیلی یا فیمبریه ، پروتئین های اتوترانسپورتر، کورلی، تولید اگزوپلی ساکارید و پیلی F جنسی ) (Soto et al. 2007.

واکنش های هیدروفوبیک نقشی را در اتصال میکروارگانیسم ها به طیف وسیعی از سطوح ایفا می کنند و تشکیل بیوفیلم را که منجر به اتصال باکتریایی می شود را تسهیل می کنند. ماهیت هیدروفوبیک خارجی ترین سطح باکتریایی به عنوان یک فاکتور در تقسیم بندی میکروارگانیسم ها، در اتصال باکتری ها به سطوح پلاستیکی، در اتصال باکتری ها به فاگوسیت ها و دیگر سلول های PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران و در رشد سلول ها بر روی لایه های نامحلول آبگریز مثل هیدروکربن ها، ذکر شده است. این یک عامل مهم در کمک به باکتری اشریشیا کلی به اتصال به سطوح مختلف برای کلونیزاسیون است.

در این تحقیق با بهره گرفتن از روش های مختلف به بررسی قدرت اتصالی اشریشیا کلی در مجاری ادراری و همچنین به نقش اندامکهای اتصالی نظیر پیلی پرداخته شده است. به طور خلاصه اهداف اصلی این پایان نامه به شرح زیر است.

اهداف تحقیق: