فصل اول : مقدمه و کلیات.. 2

فصل دوم : ی بر تحقیقات انجام شده. 7

2-1-   ترمیم شکستگیهای DNA دورشتهای: 11

2-2-   مکانیسم ترمیم شکستگی DNA دورشته ای: 12

2-2-2-   اتصال تک رشته (SSA): 13

2-2-3-   سنتز Extended وابسته به اتصال رشته ها (ESDSA): 13

2-3-   ساختار نوکلئوتید. 14

2-4-   پاسخ سلول های داینوکوکوس متعاقب اشعه گاما: 15

2-5-   ژن های دخیل در مقاومت بخشی به اشعه: 16

2-6-   منابع میکروبی مقاوم به پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی: 18

2-7-   فواید اکستریموفیلهای مقاوم در برابر تابش… 20

2-7-1-   پیامدهای دارویی اکستریمولیت های مقاوم در برابر تابش… 21

2-7-2-   پیامدهای بیوتکنولوژیکی اکستریمولیت های مقاوم در برابر اشعه 27

2-8-   محدودیتها و چالشها در دیدگاه پنج ساله 30

فصل سوم : مواد و روشها 33

3-1-   آماده سازی وکتور pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیکdr2418-opti 35

3-2-   مستعدسازی E.coli DH5a. 35

3-3-   تراریختی یا انتقال وکتور حاوی ژن سنتتیک به درون سلول مستعد E.coli DH5a. 36

3-3-1-   استخراج پلاسمید pGEM-B1 حاوی ژن سنتتیک dr2418-opti 37

3-3-2-   تایید استخراج پلاسمید حاوی ژن سنتتیک با روش آگارز ژل الکتروفورز 38

3-3-3-   آماده سازی نمونه ها برای الکتروفورز 38

3-3-4-   رنگ آمیزی DNA در ژل آگارز 39

3-3-5-   تهیه بافر TBE(10X) 39

3-3-6-   طرز تهیه ژل آگارز 39

3-3-7-   هضم آنزیمی وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزیم NdeI 40

3-3-8-   هضم آنزیمی وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزیم BamHI 41

3-3-9-   تخلیص ژن سنتتیک dr2418 از روی ژل. 41

3-3-10-   برش پلاسمید pET-21a توسط آنزیم NdeI 43

3-3-11-   برش وکتور pET-21a (هضم شده با NdeI) توسط BamHI 43

3-3-12-   لیگاسیون وکتور pET-21a و ژن سنتتیک dr2418. 44

3-3-13-   ترنسفورماسیون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5a. 45

3-4-   توالییابی ژن سنتتیک در pET-21a. 45

3-5-   القاء ساختارهای بیانی pET21a-dr2418 توسط IPTG به منظور تولید پروتئین DR2418 دارای برچسب هیستیدین (His-tagged r-dR2418): 46

3-6-   ارزیابی پروتئین DR2418 تولید شده به وسیله الكتروفورز در ژل پلی آكریلامید (SDS-PAGE) 47

3-7-   یكسان سازی غلظت كلی پروتئینها در نمونه های قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE. 50

3-8-   شناسائی و تائید پروتئین His-tagged r-DR2418 با روش Western blot 50

3-9-   نگهداری و ذخیره باكتریهای مولد پروتئین ِDR2418: 52

3-10-   بررسی پایداری پلاسمیدها (Plasmid stability Test) 53

3-11-   خالصسازی پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی. 53

3-11-1-   لیز سلولی باکتری E.coli 54

3-11-2-   آماده كردن ستون. 54

3-11-3-   تزریق نمونه و شستشو. 55

3-11-4-   جدا سازی یپروتئین نوترکیب.. 55

3-11-4-1-   روش دیالیز. 56

3-11-5-1- رسم منحنی استاندارد 56

3-11-5-2- تهیۀ محلول برادفورد 57

3-11-6-   بازیافت و نگهداری ستون. 57

 فصل چهارم : نتایج.. 58

4-1-   غربال كردن كلنی های حاوی pGEM-B1 دارای قطعه DR2418: 59

4-2-   غربال كردن كلنیهای E. coli DH5 حاوی pGEM-B1 دارای قطعه 59

4-2-1-   تایید پلاسمیدهای استخداج شده با برش آنزیمی NdeI: 60

4-2-2-   تایید پلاسمیدهای خطی شده حاوی ژن سنتتیک با هضم آنزیمی BamHI: 60

4-3-   جداسازی قطعه از روی ژل و فرایند Ligation: 61

4-3-1-   تایید صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعیین توالی: 63

4-4-   ترانفسفورم وکتور pET21a حاوی ژن dr2418 به سلول E. coli Origami و ارزیابی بیان پروتئین DR2418: 64

4-5-   شناسائی و تائید پروتئین DR2418 با روش Western Blot Wet transfer)) 64

4-6-   بیان ژن dr2418 در حجم یک لیتر محیط کشت.. 66

4-7- برسی تخلیص پروتئین بر روی ژل SDS_PAGE: 67

4-8- نتایج سنجش غلظت پروتئین: 67

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری…………. 69

 ضمیمه: 76

 پیشنهادات: 84

 منابع. 85

 چكیده انگلیسی.. 91

چکیده

زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو است و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو نقش دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو است. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد.

روش کار: ژن dr2418 داینوکوکوس رادیودورانس بصورت سنتتیک در وکتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بیانی pET21a ساب کلون شد. صحت ساب کلونینگ توسط هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. ژن dr2418 در E. coli بیان شد و پروتئین نوترکیب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید و وسترن بلاتینگ تایید شد.همچنین با بهره گرفتن از ستون کروماتوگرافی جذبی این پروتئین تخلیص گردید.

نتایج: پلاسمید pET21a حاوی ژن dr2418 به همراه برچسب هسیتیدینی در قسمت C-ترمینال بطور موفقیت آمیز ساخته شد. هم چنین، پروتئین نوترکیب DR2418بصورت داخل سلولی در E. coli ترانسفورم شده تولید ، و تخلیص آن با موفقیت انجام شد.

نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که پروتئین rDR2418 می تواند به عنوان یک کاندید مناسب پروتئین مقاوم به پرتو در نظر گرفته شود. بااین حال، خاصیت مقاومت به پرتو پروتئین DR2418 باید در سیستم های پروکاریوتی و یوکاریوتی آنالیز شود.

محیط­های دارای پرتوزایی جزء محیط­های خشن (Extreme) می­باشند و در این محیط­ها میکروارگانیسم­های مقاوم به اشعه­های رادیواکتیو در خانواده­های مختلف باکتریایی یافت می­شوند. به عنوان مثال گونه­ های جنس Deinococcus حتی در دوزهای 25 KGy از خود مقاومت نشان می­ دهند که یکی از معروف­ترین گونه­ های متعلق به جنس Deinococcus و مقاوم به اشعه، Deinococcus radiodurans می­باشد، بطوریکه این باکتری حتی در پرتوهای با دوز بالا به حیات خود ادامه می­دهد. این باکتری جزء باکتری­ های غیر بیماریزا است و می­توان آن را از محیط­های طبیعی جداسازی نمود و در محیط­های کشت آزمایشگاهی آن را کشت داد. مطالعات مختلفی در مورد مکانیسم مقاومت Deinococcus radiodurans به اشعه رادیواکتیو انجام شده است و مطالعات نشان می­دهد که ژن­های کدکننده پروتئین­های دخیل در ایجاد مقاومت به اشعه در این باکتری وجود دارد ولی مکانیسم مولکولی آن هنوز بطور کامل مشخص نشده است. با این حال مطالعات اخیر ژن­های مختلفی از قبیلDR2418، DR1709، pprI، RecX را گزارش کرده ­اند که در ایجاد مقاومت به اشعه دارای نقش بسزایی می­باشند و عملکرد آنها در زمینه از بین بردن رادیکال­های سمی اکسیژن و ترمیم DNA آسیب دیده می­باشد.

محیط­های خشن (Extreme) یکی از محیط های پرچالش برای ارگانیسم های زنده است. با این حال، تعداد زیادی از میکروارگانیسم­های متعلق به سه قلمرو حیات (باکتری­ ها، یوکاریوت­ها و آرکی­ها) از محیط­های خشن مانند هیدروترمال و محیط­های خشک در معرض اشعه UV، محیط های بسیار گرم جداسازی شده اند. در میان این ارگانیسم­های مقاوم به شرایط خشن، باکتری­ های متعلق به خانواده Deinococcaceae توانایی بسیار بالایی برای زیستن در محیط های در معرض اشعه های یونیزان دارند و Deinococcus radiodurans یکی از بهترین گونه هایی است مورد مطالعه قرار گرفته است.

این باکتری توسط توانایی استثنایی اش در مقابله با اثرات تخریب کننده ساختار DNA از جمله اشعه یونیزان، نور ماورای بنفش و شرایط خشکی مورد شناسایی قرار گرفته است.

اشعه­های یونیزان توسط تخریب عناصر رادیواکتیو تولید می شود و منجر به تولید الکترون ها و یون های مختلف می شود. اشعه های گاما فوتون هایی هستند که مولکول های سلولی را تغییر می دهند و رادیکال های هیدروکسیل بسیار فعال تولید می کنند (ROS) بخصوص OH. توسط یونیزاسیون مولکول های آب. این رادیکال های آزاد بطور مستقیم و غیرمستقیم باعث تخریب DNA می شوند و تغییرات بازی و شکست دورشته و تک رشته DNA را بوجود می آورند. مطالعات نشان می دهد که 80% از تخریب DNA ناشی از عملکرد ROS است و فقط 20% توسط برهم کنش مستقیم فوتون های گاما و DNA است و تعداد شکست های DNA دو رشته ای نسبت مستقیم با اندازه ژنوم دارد (Gerard E , 2001). اولین مسیر حفاظت علیه استرس اکسیداتیو وجود آنزیم های آنتی اکسیدان همانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز است که بیومولکول ها را از آسیب هاب ناشی از ROS محافظت می کند (شکل 1). سوپراکسید دیسموتاز تبدیل اکسیژن را به سوپراکسید اکسیژن کاتالیر می کند تا در نهایت پراکسید هیدروژن به H2O تبدیل شود (شکل 1). مطالعات نشان می دهد که D. radiodurans در هنگام مواجه با اشعه یونیزان سه نوع سوپراکسید دیسموتاز و سه کاتالاز کد می کند. در آرکی ها، سوپراکسید دیسموتاز توسط ارگانیسم­های هوازی (نظیر Halobacterium) و چند ارگانیسم بی هوازی مانند Methanosarcina barkeri کد می شود. در ارگانیسم های بی هوازی سوپراکسید ردوکتاز (SOR) کد می شود (شکل 1). سوپراکسید ردوکتاز در هنگام اکسیده شدن نیاز دارد تا توسط روبردوکسین احیا شود که خودش هم توسط آنزیم NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز (NROR) اکسیده می شود. در نهایت پراکسید به H2O توسط عملکرد روبرترین تبدیل می شود. علاوه بر این، بعضی از ارگانیسم های بی هوازی، از مسیرهای بدون تولید پراکسید هیدروژن، برای حذف سوپراکسید استفاده می کنند (تصویر C1). مطالعات کریستالوگرافی نشان می دهد که سوپراکسید ردوکتاز با فروسیانین کمپلکس تشکیل می دهد (Adam V , 2004). این کمپلکس بطور موثر با رادیکال های سمی اکسیژن واکنش می دهد و محصول نهایی واکنش پراکسید هیدروژن نیست
اما فورمات و H2O تولید می­ شود (شکل 1).

شکل 1. مسیرهای سمیت زدایی سوپراکسید اکسیژن در (A) هوازی ها و ارگانیسم های بی هوازی (B و C). Cyt bd: سیتوکروم bd یوبی کوئینول اکسیداز. Prx: پروکسی ردوکسین، rd: روبردوگسین، SOD: سوپراکسید

دیسموتاز، SOR: سوپراکسید ردوکتاز، NROR: NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز.

 در این تحقیق در نظر است پروتئین DR2418 به صورت نوترکیب تهیه تا در تحقیقات آتی از آن استفاده شود.

به طور خلاصه اهدف این تحقیق به شرح زیر است: