فصل اول- مقدمه                                                                

   مقدمه وهدف………………………………………………………………………………………………………………..4

فصل دوم-ی بر تحقیقات گذشته                                          

2-1- خصوصیات سالمونلا……………………………………………………………………………………………..8          

2-1-1- تاریخچه…………………………………………………………………………………………………………….8          

2-1-2- طبقه بندی………………………………………………………………………………………………………….9          

2-1-3- خصوصیات ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک………………………………………………………10        

2-1-4- حساسیت به مواد شیمیایی………………………………………………………………………………….12        

2-1-5- ساختار پادگنی سالمونلا……………………………………………………………………………………12        

2-1-6- روش های طبقه بندی……………………………………………………………………………………….14        

2-1-7- شرایط رشد سالمونلا………………………………………………………………………………………..15         

2-1-8- بقا سالمونلا……………………………………………………………………………………………………..17        

2-1-9- منشا سالمونلا…………………………………………………………………………………………………..20        

2-2- آلودگی در انسان………………………………………………………………………………………………….21        

2-2-1- میزان شیوع سالمونلوز در انسان…………………………………………………………………………22

2-2-2- علائم سالمونلوز در انسان…………………………………………………………………………………23

2-2-3- دوز آلوده کننده……………………………………………………………………………………………….25

2-2-4- پیشگیری………………………………………………………………………………………………………..25

2-3- سالمونلوز در حیوانات…………………………………………………………………………………………26

2-4- سالمونلوز در پرندگان………………………………………………………………………………………….27

2-4-1- آلودگی در طیور………………………………………………………………………………………………27

2-4-2- میزان شیوع…………………………………………………………………………………………………….28

2-5- روش های تشخیص سالمونلا………………………………………………………………………………..29

2-5-1- روش های کشت……………………………………………………………………………………………29

2-5-2- روش سرولوژیکی………………………………………………………………………………………….30

2-5-3- روش الایزا…………………………………………………………………………………………………. 30

2-5-4- روش آگلوتیناسیون به كمك لاتكس………………………………………………………………. 31

2-5-5-1-روشPCR……………………………………………………………………………………………….. 31        

2-5-5-2-   جستجو وآنالیز محصولاتPCR………………………………………………………………. 31

2-5-5-3- بهبود حساسیت و ویژگی تکثیرPCR………………………………………………………….33

2-5-5-4-   اجزای PCR…………………………………………………………………………………………..33

2-5-5-5- سابقه PCR در شناسایی سالمونلا……………………………………………………………….34

فصل سوم:مواد و روش ها ………………………………………………………………………………………….44          

3-1- وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………………………..45

3-2- مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………46

3-3- گرد آوری نمونه های آزمایشی……………………………………………………………………………46

3-4-1- مواد و وسایل لازم برای تهیه محیط…………………………………………………………………46

3-4-2- مواد و وسایل لازم جهت کشت نمونه……………………………………………………………..46

3-4-3- کشت در محیط جامد انتخابی…………………………………………………………………………47

3-5- آزمون های بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………47

3-5-1- کشت در محیط آهن دار سه قندی…………………………………………………………………..47

3-5-2- آزمون اوره آز……………………………………………………………………………………………… 48        

3-5-3- آزمون وژس پروسکوئر………………………………………………………………………………….48

3-5-4- آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………..49

3-5-5- آزمون سیترات………………………………………………………………………………………………49

3-5-6- آزمون حرکت………………………………………………………………………………………………..49

3-6- آزمون رنگ آمیزی گرم……………………………………………………………………………………..49

   3-6-1- تهیه گسترش روی لام…………………………………………………………………………………..50

   3-6-2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله…………………………………………………………………………50

3-6-3- مرحله شستشو……………………………………………………………………………………………..51

   3-6-4- مرحله اضافه کردن محلول ید…………………………………………………………………………51

   3-6-5- مرحله رنگ بری با بهره گرفتن از استن – الکل………………………………………………………51

   3-6-6- رنگ آمیزی با فوشین…………………………………………………………………………………….51

 

 

   3-6-7- خشک کردن لام……………………………………………………………………………………………51

 3-6-8-نکات مهمی که هنگام رنگ آمیزی گرم باید مورد توجه قرار گیرد ………………………51

   3-7- استخراج DNA………………………………………………………………………………………………52                                                                    

3 -7-1-   مواد و وسایل لازم……………………………………………………………………………………..52

3-8- آزمون PCR………………………………………………………………………………………………….. 52                                                                                              

3-8-1- مواد و وسایل لازم……………………………………………………………………………………….52

3-8-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………53

3-9- الکتروفورز محصولاتPCR………………………………………………………………………………54                                                                  

3-9-1- مواد و وسائل لازم……………………………………………………………………………………….54      

3-9-2- تهیه بافر 1x………………………………………………………………………………………………..55

3-9-3- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………55

3-8-4- بارگذاری محصولات .PCR…………………………55              

3-10- مشاهده باند های روی ژل………………………………………………………………………………56                                                      

3-10-1- مواد و وسایل لازم…………………………………………………………………………………….56

فصل چهارم :نتایج                                                                      

4-1 نتایج………………………………………………………………………………………………………………..58

4-2- کشت در محیط جامد انتخابی……………………………………………………………………………58

4-2-1- کشت در محیط XLD ………………………………………………………………………………..58                                                                            

4-2-2-کشت در محیط سالمونلا شیگلا آگار……………………………………………………………….59

4-3-آزمون گرم………………………………………………………………………………………………………..59

4-4-تست های بیو شیمیایی…………………………………………………………………………………………..60

4-4-1-آزمون .TSI……………………………………………………………………………………………………..60

4-4-2-آزمون اوره آز………………………………………………………………………………………………….60

4-4-3-آزمون ..VP…………………………………………………………………………………………………61

4-4-5-آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………….61

4-4-6-آزمون سیترات………………………………………………………………………………………………… 61

4-4-7-آزمون حرکت…………………………………………………………………………………………………..62

4-5-استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………..63

4-5-1-استخراج توسط KOH 5/0 مولار………………………………………………………………………63

4-6-آزمونPCR…………………………………………………………………………………………………………63

4 -7-نتایج آزمون کای دو……………………………………………………………………………………………67

فصل پنجم : بحث و پیشنهادات                                                                            

5-1- بحث………………………………………………………………………………………………………………..69

5-2- نتیجه گیری نهایی………………………………………………………………………………………………77

5-3-پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………….78

چكیده:

عفونت‌های سالمونلایی كه عفونت های غذایی نامیده می‌شوند، ممكن است توسط هر یک از سرووارها ایجاد شود. معمولا باكتری عامل عفونت در ماده غذایی رشد می‌كند تا به مقدار قابل توجهی برسد. به این ترتیب احتمال عفونت افزایش یافته و موجب بروز بیماری در خانواده‌ها و گروه‌های بزرگ می‌شوند. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی‌های غذایی انسان و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری‌زا در انسان‌هاست. سالمونلا باكتری گرم منفی، متحرك و باسیلی شكل است كه خصوصیات عمومی خانواده انتروباكتریاسه را داراست. امروزه بیش از 2450 سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است كه برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروكولیت در انسان می‌باشند. در این مطالعه 50 نمونه مدفوع افراد مبتلا به اسهال از سطح بیمارستان‌های شهرستان سبزوار جمع‌ آوری گردید و با رعایت كامل موارد بهداشتی به آزمایشگاه تخصصی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار منتقل شدند. برای جداسازی اولیه از محیط كشت‌های بافر پپتون واتر ، سلنیت F براث ،XLD و SS آگار استفاده گردید. جهت تایید تشخیص از تست‌های بیوشیمیایی نظیر TSI و اوره آگار و VP، اندول و سیمون سیترات و حرکت استفاده شد. در مطالعه حاضر 10 مورد باكتری سالمونلا با بهره گرفتن از روش كشت میكروبی جدا شد. این در حالی است كه با بهره گرفتن از روش مولكولی Multiplex PCR ، 21 مورد باكتری سالمونلا در نمونه‌ها ردیابی گردید. بنابراین می‌توان گفت كه روش PCR نسبت به كشت میكروبی از دقت بالاتری برخوردار است و همچنین روش‌های سنتی كشت میكروبی اغلب زمان‌بر خسته‌كننده و پرهزینه است.

واژه‌های كلیدی: سالمونلا ، Multiplex PCR ، مدفوع

 مقدمه و هدف:

در طول دهه گذشته وقوع بیماری‌ها و عفونت های با منشا غذایی نه تنها در كشورهای در حال توسعه و با فقر بهداشتی، بلكه در كشورهای توسعه یافته و با استانداردهای بالای بهداشتی نیز رو به افزایش بوده و این در حالی است كه وقوع عفونت‌ها و مسمومیت‌های غذایی اغلب گزارش نشده باقی می‌ماند و لذا تعیین آمار دقیق از میزان ابتلا خصوصاً در كشورهای درحال توسعه امكان‌پذیر نمی‌باشد. غذا می‌تواند به عنوان یک حامل، بسیاری از میكروارگانیسم‌های عامل عفونی یا غیر عفونی را در خود حمل کند که در بعضی از شرایط، رشد عامل عفونی را حمایت کرده و به عنوان ناقل فعال عمل نموده و یا تنها نقش ناقل غیرفعال را ایفا می کند كه در این صورت عامل عفونت در غذا رشد ننموده و یا تنها به وسیله‌ی غذا به انسان منتقل می‌شود. بیماری‌های غذایی جزء بیماری‌های روده‌ای تقسیم‌بندی می‌شوند كه از نظر اهمیت در آمریكا بعد از بیماری‌های ریوی در مقام دوم قرار دارند. در یک بررسی در ایالات متحده گزارش شده كه بطور مستقیم هر آمریكایی حداقل هر سال یكبار به بیماری‌های روده‌ای با علامت اسهال مبتلا می‌شوند. گفته می‌شود كه این مسئله به خاطر ناسالم بودن غذای تولید شده در این كشور نیست بلكه مردم با عمل‌آوری غلط و غیربهداشتی و یا از طریق انتقال عوامل عفونی خود غذا را ناسالم می‌كنند (مهرور و همکاران،1385).

برطبق مطالعات انجام شده همه ساله بیش از هزار میلیون مورد اسهال حاد در بین بچه‌های زیر پنج سال در كشورهای آمریكا، آسیا (به استثنای چین) و آمریكای لاتین اتفاق می‌افتد كه به مرگ بیش از پنج میلیون نفر منجر می‌گردد. در كشورهای صنعتی مشكل كمتر از این‌هاست ولی به طور معنادار هنوز از اهمیت خاصی برخوردار است. طبق گزارش‌های موجود تنها در یک همه‌گیری آن هم در كشوری مثل آمریكا بیش از 15000 نفر در اثر مصرف شیرآلوده به سالمونلای مقاوم به آنتی‌بیوتیک مبتلا شدند. باكتری‌ها به عنوان مهم‌ترین عوامل در بروز بیماری‌های ناشی از مصرف غذا می‌باشند(اردستانی و همکاران،1386). از جمله این عوامل بیماری‌زا خانواده انتروباكتریاسه است(تاجبخش،1386). خانواده انتروباكتریاسه از تعداد زیادی باكتری گرم منفی تشكیل شده كه قرابت بسیاری با هم دارند و در آب و خاك و مواد در حال فساد و گیاهان و دستگاه گوارش انسان و حیوانات و حشرات یافت می‌شوند. از آن جا كه جایگاه اصلی و طبیعی این باكتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریک می‌نامند. باكتری‌های جنس سالمونلا گرم منفی، هوازی و بی‌هوازی اختیاری، باسیلی شكل به اندازه‌ی 5-2 × 5/1 – 7/0 میكرون هستند که خصوصیات عمومی خانواده انتروباكتریاسه را دارا می‌باشند (تاجبخش،1376).

از لحاظ شرایط رشد این میكروارگانیسم‌ها باكتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌كنند. این جنس از میكروارگانیسم‌ها به حرارت حساسند. در درجه حرارت‌های پائین امكان بقای آنها بیشتر است. اكثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باكتری در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران و پرندگان و خزندگان و ماهی ها سیطره پیدا کرده و بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی ، بیماری‌هایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌كنند(زهرایی صالحی،1388). این باكتری‌ها معمولاً از طریق مدفوع انسان یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می گردند. انسان و حیوانات در بیشتر موارد در اثر مصرف این‌گونه مواد آلوده، باكتری را وارد دستگاه گوارش خود كرده و در نتیجه این گردش دهانی – مدفوعی تداوم می‌یابد(زهرایی صالحی،1388). باكتری سالمونلا انتریكا مهم‌ترین عامل در ابتلا به بیماری سالمونلوز در انسان می‌باشد به طوری كه شیوع عفونت‌های سالمونلا انتریتیدیس به خصوص در دهه اخیر افزایش یافته است. فرد آلوده با سرووارهای سالمونلا انتریكا اغلب مبتلا به تب، دردهای ماهیچه‌‌های شكمی و اسهال می‌باشد. شروع این علائم از 12 ساعت تا یک هفته پس از مصرف غذای آلوده ادامه دارد. این بیماری اغلب 4 تا 7 روز به طول می‌ انجامد در بسیاری از افراد بدون درمان با آنتی‌بیوتیک بهبود می‌یابند. با این حال، اسهال می‌تواند شدید و گاهی اوقات منجر به بستری شدن افراد در بیمارستان گردد. بیماری در شیرخواران، كودكان و همچنین افراد مسن شدت داشته و نگران‌كننده می‌باشد. در مواردی بیماری می‌تواند به مرگ و میر در افراد حساس منجر شود(یوسفی مشعوف و همکاران ،1380) .

امروزه در آزمایشگاه‌های میكروب‌شنای از سه روش رایج جهت شناسایی و تشخیص باكتری استفاده می‌شود.

1- روش كشت سنتی و بیوشیمیایی كه با تهیه نمونه و تهیه محیط كشت و تشخیص باكتری استفاده می‌شود.

2- روش‌ها سرولوژیكی: برپایه تشخیص آنتی‌ژن‌های تولید شده توسط باكتر (آنتی‌ژن O و H) است.

3- روش‌های مولكولی: واكنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) یكی از رایج‌ترین روش‌های مولكولی است كه بر اساس حضور ژن خاص و یا به عبارت دیگر قطعه‌ای از DNA است در این روش قطعه‌ای از ژن هدف تشكیل شده و وجود عامل پاتوژن اثبات می‌گردد. چندین ژن هدف در سویه‌های سالمونلا وجود دارد(,…,( InvA, spvC, InvB, OmpC(کارلسون و همکاران، 2004).

ژن InvA كه برای تهاجم باكتری سالمونلا لازم است و بوسیله آن باكتری به قسمت‌های عمقی‌تر روده نفوذ می‌كند برای جنس سالمونلا اختصاصی است(گورین و همکاران،2005).

در این تحقیق كه در دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار انجام گرفت بر روی نمونه‌های كلینیكی (مدفوع) با بهره گرفتن از محیط‌های اختصاصی سالمونلا و سپس با روش مولكولی Multiplex PCR به شناسایی عوامل پاتوژنی سالمونلا پرداختیم. هدف از این مطالعه ارزیابی تناسب ژن invA ،ompC و rfs به وسیله Multiplex PCR ،به عنوان روش اختصاصی برای تشخیص برخی از سرووارهای سالمونلا انتریکا در نمونه های کلینیکی (مدفوع)بود . همچنین مقایسه روشPCR با روش های کشت سنتی و اختصاصی برای تشخیص سالمونلا بود.

2-1-خصوصیات سالمونلا :