عنوان        صفحه

چکیده 1

 فصـل اول: کلیات تحقیق

1-1- فسفر و نقش آن در طبیعت.. 3

1-1-1- فسفر. 3

1-1-2- تاریخچه فسفر. 5

1-1-3- نقش فسفر در گیاه 6

1-1-4- جذب و انتقال فسفر. 7

1-1-5- نقش فسفر در گیاه 7

1-1-6 جذب فسفر. 9

1-1-7- چرخه فسفر. 10

1-1-8- برهمکنش فسفر با دیگر عناصر. 11

1-1-9- مشکلات مصرف زیاد فسفر. 12

1-1-10- کمبود فسفر. 12

1-1-11- علائم كمبود فسفر. 13

1-1-12- مشكلات مصرف زیاد فسفر. 14

1-1-13- راه های جلوگیری از كمبود و بیش بود فسفر. 14

1-1-14- تثبیت فسفرچیست؟. 15

1-1-15- روش‌های كاهش تثبیت فسفر. 16

1-1-16- نقش فسفر در گیاه 16

1-2- انتقال ژنتیکی. 16

1-3- انتقال ماده غذایی. 17

1-4- فاضلاب.. 17

1-4-1- میزان مواد آلی در فاضلابها 18

1-4-2- درجه بندی فاضلاب ها 19

1-4-3- فاضلاب های غیر انسانی.. 19

1-4-4- تخلیه بی رویه فاضلاب های صنعتی در آب های سطحی.. 19

1-4-5 مواد شیمیایی، ایجاد کننده اصلی فاضلاب صنعتی.. 20

1-4-6- میکروارگانیسم ها و تصفیه ی فاضلاب ها و محیط زیست… 21

1-4-7- کاربرد میکروارگانیسم ها در صنعت تصفیه ی فاضلاب ها 21

1-4-8 مهمترین عوامل ضرورت عدم تخلیه فاضلابهای صنعتی به آبهای جاری و زیر زمینی.. 22

1-5 تصفیه زیستی یا تصفیه بیولوژیکی. 25

1-5-1 روش های تصفیه زیستی با کمک باکتری های هوازی.. 27

 فصـل دوم: سابقه و پیشینه تحقیق

2-1- حذف آلاینده ها و فاضلابها 30

2-2- پدیده اوتریفیکاسیون یا یوتریفیکاسیون. 30

2-3- اثرات یوتریفیکاسیون بر روی منابع آب قابل استفاده برای انسان. 31

2-4- تصفیه زیستی فاضلاب.. 32

2-5- موجودات هتروتروف.. 33

2-6- ارتباط بین چرخه فسفر و چرخه آهن. 34

2-7- اهمیت فسفر 35

2-8- تاریخچه تصفیه فاضلاب.. 36

2-9- حذف فسفر از فاضلابها 38

2-10- راندمان حذف فسفر توسط رسوب شیمیایی. 40

2-11- خصوصیات میکروبیولوژی PAOs: 41

 فصـل سوم: مواد و روشها

3-1- وسایل مورد استفاده 44

3-2- مواد مورد استفاده 45

3-3- روش کار 46

3-3-1- نمونه گیری.. 46

3-3-2 غنی سازی و کشت… 46

3-3-3 محیط کشت :Seperb. 46

3-4- شناسایی. 48

 

 

3-4-1- روش بیو شیمیایی.. 48

3-4-2- روش مولکولی.. 48

3-4-3- آزمون های بیو شیمیایی: 49

3-4-3-1- واکنش گرم. 49

3-4-3-2- احیای نیترات… 50

3-4-3-3- تولید هیدروژن سولفید و توانایی حرکت… 51

3-4-3-4- اکسیداز. 52

3-4-3-5- کاتالاز. 52

3-4-3-6- سیترات… 52

3-4-3-7- آزمونOF (Oxidation/Fermentation). 54

3-4-3-8- آزمون MR / VP.. 55

3-4-3-9- هیدرولیز نشاسته. 56

3-4-3-10- هیدرولیز کازئین.. 57

3-4-3-11- تجزیه ژلاتین.. 57

3-4-3-12- شناسایی مولکولی جدایه ها با بهره گرفتن از تکنیک PCR.. 58

3-4-3-13 استخراج DNA.. 59

3-4-3-14- تهیه ژل آگارز. 60

3-4-3-15- روش تهیه ژل آگارز یکدرصد و الکتروفورز نمونه های ژنومی.. 61

3-4-3-16-PCR.. 62

 فصل چهارم : نتایج

4-1- جداسازی باکتری های حذف کننده ی فسفات از فاضلاب صنعتی: 67

4-2- شناسایی باکتری های حذف کننده ی فسفات: 67

4-2-1 آزمون های بیوشیمیایی: 68

4-3- ارزیابی کمی توان حذف فسفات توسط جدایه های باکتریایی. 71

4-4 اندازه گیری هاله حذف فسفات: 72

4-5- نتیجه ی اندازه گیری هاله ها 73

4-6- بررسی هاله ایجاد شده 74

4-7- بررسی مقدار فسفات جذب شده توسط جدایه ها 75

4-8- نتایج مربوط به شناسایی مولکولی باکتری. 77

4-8-1 نتایج کیفی و کمی استخراج DNA.. 77

4-8-1-1 بررسی نتایج کیفی.. 77

4-8-1-2 بررسی نتایج کمی.. 77

4-8-2 نتایج PCR.. 78

4-8-2-1 نتایج تعیین توالی.. 78

 فصـل پنجم: بحث

5-1- جداسازی و شناسایی باکتری های حذف کننده ی فسفات: 93

:Brevundimonas diminuta-1-1-5. 93

Ochrobactrum grignonense-2-1-5: 93

Exiguobacterium sibiricum-3-1-5: 94

5-2- خصوصیات جدایه های باکتریایی حذف کننده ی فسفات از فاضلاب صنعتی. 95

5-3- تخمین کمی حذف فسفات توسط جدایه ها در محیط seperb. 95

پیشنهادات.. 96

چکیده

امروزه از آب های پذیرنده نظیر دریاچه ها و رودخانه ها به عنوان محلی برای دفع فاضلاب ها و پساب ها استفاده می شود. از جمله آلاینده هایی كه از طریق دفع پساب ها و فاضلاب ها وارد آب های پذیرنده می شوند، تركیبات مغذی خصوصاً نیترات ها و فسفات ها هستند. ورود این آلاینده ها به منابع آبی باعث غنی شدن پیكره آبی به وسیله تركیبات مغذی مذکور می شود كه خود باعث افزایش رشد و تكثیر گیاهان آبزی علی الخصوص جلبك ها شده و پدیده یوتریفیكاسیون را سبب می گردند. در روش شیمیایی با بهره گرفتن از مواد شیمیایی و رسوب دادن، آلاینده ها را از محیط جدا می کنند. این روش اغلب هزینه بر و گاهی نیز به دلیل سمیت مواد اضافه شده به محیط آسیب وارد می شود. در روش های بیولوژیکی با بهره گرفتن از میکروارگانیسم های جاذب فسفات و دنیتریفیکانت ها حذف این مواد از محیط صورت می گیرد، كه فسفر حذف شده از پساب به عنوان پلی فسفات داخل سلولی در می آید. این روش به دلیل هزینه پایین، کم خطر بودن و رسیدن این مواد به حد استاندارد بین المللی مورد توجه قرار گرفته است.

امروزه با افزایش شناخت از میکروارگانیسم ها و پیشترفت علم یکروب شناسی و بیوتکنولوژی استفاده از میکروب ها بعنوان راهبردی، جهت حذف آلاینده های موجود در فاضلاب بخصوص فسفات مطرح می گردد.این مطالعه با هدف جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری های حذف کننده ی فسفات از فاضلاب صنعتی انجام گرفت. در این مطالعه از نمونه های فاضلاب شهرکی صنعتی آق قلا جهت جداسازی باکتری های حذف کننده ی فسفات استفاده شد.در مجموع 30 جدایه با بهره گرفتن از محیط اختصاصی seperb وبر پایه ی تشکیل هاله ی شفاف اطراف کلنی ناشی از حذف فسفات موجود در محیط جداسازی شدند. تمامی این جدایه ها تا سطح جنس و گونه با بهره گرفتن از کتاب راهنمای شناسایی سیستماتیک باکتریهای برجی (2006) شناسایی مقدماتی شدند.از بین این 30 جدایه، 3 جنس باکتری با توجه به بزرگتر بودن هاله ی اطراف آنها نشان می داد که فسفات بیشتری را از محیط حذف کردند. شناسایی مولکولی این باکتریها با بهره گرفتن از تکنیک PCR بر پایه ژن 16SrRNA نشان داد که این جدایه ها منسوب به 3 جنس Brevundimonas، Ochrobactrum و Exiguobacterium می باشند.

 کلمات کلیدی: حذف فسفات، فاضلاب صنعتی،محیط کشت seperb

1-1- فسفر و نقش آن در طبیعت

1-1-1- فسفر 

فسفر یک عنصر شیمیایی جدول تناوبی است که نماد آن P و عدد اتمی آن 15 میباشد. فسفر یک عنصر غیر فلزی چند ظرفیتی گروه نیتروژن بوده و معمولا در سخره ها و کانی های فسفاتی و همچنین در تمام سلولهای زنده یافت میشود ولی هیچگاه به صورت طبیعی تنها و بدون ترکیب با عناصر دیگر وجود ندارد. فسفر بسیار واکنش پذیر بوده و هنگام ترکیب با اکسیژن نور کمی از خود انتشار می دهد. از عناصر لازم و حیاتی ارگان های زنده بوده و نامش به شکلهای گوناگون ذکر می شود. مهمترین استفاده فسفر در تولید کود می باشد. همچنین در تولید مواد منفجره کبریت آتش بازی مواد حشره کش خمیر دندان و مواد شوینده و همچنین مانیتورهای کامپیوتر نیز کاربرد دارد فسفر معمولا به شکل یک ماده جامد و موم مانند سفید رنگ است که بوی نامطبوعی دارد. فسفر خالص بی رنگ و شفاف است. اگرچه این نافلز در آب قابل حل نیست ولی در دی سولفید کربن حل می شود. فسفر خالص به سرعت در هوا می سوزد و تبدیل به پنتا اکسید فسفر می شود فسفر به چهار پنج شکل مختلف وجود دارد. ( سفید یا زرد، قرمز سیاه (یا بنفش). که متداول ترین آنها فسفر قرمز و سفید میباشند که هر دوی آنان از گروه چهار اتمی های چهار وجهی
می­باشند. فسفر سفید در تماس با هوا می سوزد و در مجاورت با گرما یا نور به فسفر قرمز تبدیل میشود که دو حالت آلفا و بتا دارد که با انتقال دمای -3.8 درجه سانتیگراد از هم تفکیک می شوند. در عوض فسفر قرمز پایدار تر بوده و در فشار بخار 1 اتمسفر در 17 درجه سانتیگراد تصعید می شود و از تماس و یا گرمای مالشی می سوزد. فسفر سیاه چندشکلی Allotrope هم در ساختاری مشابه گرافیت که در آن اتمها در یک صفحه شش وجهی چیده شده و هادی جریان الکتریسیته هستند وجود دارد. اسید فسفریک غلیظ شده که 70درصد تا 75درصد (P2O)5دارد، در(کشاورزی و تولید کود بسیار مهم می باشد). در نیمه دوم قرن بیستم نیاز بیشتر به کودها تولیدات فسفری را به مقدار قابل توجهی افزایش داد. (Rodriguez et al : 1999)

فسفر بعد از ازت مهم‌ترین عنصر غذایی در تغذیه گیاه است. نقش فسفر برخلاف ازت كه در رشد رویشی گیاه مهم است، در رشد زایشی و تشكیل گل و میوه مهم‌تر و موثرتر است. منبع اصلی تأمین فسفر مورد نیاز گیاه، كودهای فسفری است. كودهای فسفری از سنگ معدن فسفات تهیه می‌شوند. تغذیه فسفری قدمت طولانی دارد. در قدیم تولیدكنندگان استخوان را زیر خاك می‌كردند تا فسفر مورد نیاز را تهیه كنند و اصولاً صنعت كود سازی فسفری به این طریق شروع شد. محققین با اضافه كردن اسید بر روی استخوان، فسفر موجود در استخوان را برای گیاه قابل استفاده می‌كردند. كودهای فسفری از سنگ معدن فسفر (آپاتیت) تولید می‌شود. و با افزودن اسید سولفوریک به سنگ معدن فسفات، كود سوپر فسفات تهیه می‌شود كه دارای منو كلسیم فسفات و مقداری گچ است. این كود 26درصد (P2O)5 دارد. كود سوپر فسفات ساده 16درصد تا 20درصد (P2O)5 دارد. كود سوپر فسفات تریپت حدود 47درصد (P2O)5 دارد و بدلیل اینكه درصد فسفات زیادی دارد، سوپر فسفات غلیظ هم نامیده می‌شود. كود فسفات آمونیوم به عنوان كود فسفری و كود ازتی مورد استفاده قرار می‌گیرد. كودهای فسفری محلول هستند(Rodriguez et al : 1999).

دیگر کاربردهای فسفر عبارتند از:

1-فسفر برای تولید شیشه مخصوص برای لامپهای سدیمی استفاده میشود.

2-فسفات کلسیم یا Bone-Ash برای تولید ظروف چینی مرغوب و Mono_calcium Phosphate که در بکینگ پودر مصرف دارد استفاده می شود.

3-همچنیند این عنصر در تولید فلزات برنز فسفات و دیگر فلزات استیل کاربرد دارد.

4-تری سدیم فسفات در ماده های تصفیه کننده برای شیرین کردن آب و همچنین جلوگیری از فرسایش لوله­ها کاربرد دارد.

5-از فسفر سفید در ساخت بمب های آتش زا و دود زا و گلوله های رسام استفاده می شود.

6-فسفر کاربردهای گوناگون دیگری در ساخت کبریت­های بی­خطر، مواد آتش­زا، حشره­کش­ها، خمیردندان­ها و مواد پاک کننده دارد.

ترکیبات فسفری نقش حیاتی در تمام گونه های حیات شناخته شده در زمین دارد. فسفرهای معدنی نقش کلیدی در ملکولهای بیولوژیکی مانند DNAو RNA که قسمتی از استقامت های ملکولی را شکل
می دهند بازی می کنند. همچنین سلولهای زنده از فسفرهای معدنی برای ذخیره و انتقال انرژی سلولی از طریق تری فسفات آدنوزین ATP استفاده می کنند. نمکهای فسفات کلسیوم هم توسط حیوانات برای سفت شدن استخوان استفاده می شود. ضمناً فسفر یک عضو حیاتی برای پروتوپلاسمهای سلولی و بافتهای عصبی می­باشد، فسفر (که یونانی آن فسفروس به معنای”حامل روشنایی” و از نامهای باستانی سیاره زهره می باشد) در سال 1669 توسط شیمیدان آلمانی Henning Brand در حین تولید یک دارو از ادرار کشف شد. براند با تبخیر ادرار سعی در تقطیر نمک داشت که در این فرایند ماده سفید رنگی تولید شد که در تاریکی
می­درخشید و با نور زیادی می­سوخت. از آن روز تابندگی فسفری برای شرح اشیاءی که در شب بدون سوختن می درخشند بکار برده شد.