چکیده : باکتری E.coliO157H7 یکی از عوامل اصلی ایجاد کننده مسمومیت غذایی و بیماری هایی مانند : اسهال، کولیت خونریزی دهنده، سندرم اورمیک همولتیک، پورپورای ترمبو سیتوپنیک و حتی مرگ در انسان است. هدف این پژوهش ارزیابی ژن‌های بیماری زای 1stx, 2stx, eaeA در نمونه های ادراری شهرستان الشتر می باشد.

روش کار: در این پژوهش 100 نمونه عفونت ادراری از سه بیمارستان شهرستان الشتر به مدت 6 ماه جمع آوری شد و پس از کشت روی محیط های اختصاصی با بهره گرفتن از روش Multiplex PCR وجود ژن های 1stx, 2stx, eaeA مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج : از 100 نمونه عفونت ادراری مورد ارزیابی، تعداد 2 جدایه با درصد فراوانی(2%) دارای ژن های 2stx, eaeA بودند. یک جدایه (1%) دارای ژن 2stx بود و هیچ نمونه ای با هر سه ژن مشاهده نشد.

نتیجه گیری: از آنجایی که اشریشیا کلی 7H:157O یکی از نگرانی های اساسی بهداشت و سلامت انسان محسوب می شود . بایستی مورد توجه دائمی قرار گیرد. راه های پیشگیری می تواند موجب کاهش آلودگی به این باکتری شود.

کلمات کلیدی : اشریشیا کلی 7H157O _ژن های شیگا توکسین _ عفونت ادراری.

مقدمه :            

عفونت های مجاری ادراری (Urinary Tract Infections) از شایع ترین بیماری های عفونی در تمام دوران زندگی و از علل شایع مراجعات پزشکی می باشد. این عفونت ها از نظر فراوانی بعد از بیماری های تنفسی قرار دارند و یکی از عمده ترین عفونت های باکتریایی در کشور های صنعتی و در حال توسعه محسوب می شوند (11). UTI از جمله مشکلات حادی است که سالانه میلیون ها انسان با آن روبرو هستند و در تمام دوران زندگی در هر دو جنس مرد و زن بروز می کند. هر ساله بین 8 تا 10 میلیون مراجعه به پزشک به علت عفونت های ادراری می باشد (14). عفونت های مجاری ادراری علاوه بر آنکه خود به خود و به تنهایی بیماری آزار دهنده ای است گاهی سبب بروز بیماری های دیگری نیز خواهد شد. مثلاً برخی از عفونت های دستگاه ادراری می توانند گاهی باعث از کار افتادگی کلیه ها شوند و یا عفونت کلیوی در خون پخش شده و سپس در تمام بدن گسترش یابند. یا برخی عفونت ها ممکن است به ایجاد سنگ کلیه در بیماران منتهی شوند که همه این ها نشان دهنده اهمیت شناسایی، بررسی میزان شیوع و درمان این بیماری است (15). راهکارهای مرتبط با تشخیص، درمان و پیگیری عفونت های ادراری روز به روز در حال تغییر هستند. لذا می بایست رویکرد هایی کارآمد و با پیچیدگی نسبتاً کمتر برای این ارزیابی ها توصیه شود و بسیار مهم خواهد بود که پزشکان خانواده قادر به تشخیص به موقع و درمان مناسب عفونت های ادراری در بیماران باشند. بیش از 90 درصد موارد عفونت های ادراری توسط باکتری ها ایجاد می شود و در بقیه موارد ویروس ها، انگل ها و قارچ ها دخیل خواهند بود. شایع ترین عوامل عفونت ادراری اعضای خانواده انتروباکتریاسه علی الخصوص اشرشیا کلی و در رتبه های بعدی انتروباکتر، سراشیا، کلبسیلا و پروتئوس می باشند. انواعی از کوکسی های گرم مثبت نیز در بروز این نوع عفونت نقش قابل ملاحظه ای خواهند داشت (14). بررسی های اپیدمیولوژیک نشان داده است که عفونت ادراری به سنین خاصی محدود نشده بلکه در تمام گروه های سنی از جمله در نوزادان، کودکان و بزرگسالان مشاهده می شود (15). اشرشیا کلی شاخص ترین عامل باکتریال عفونت های ادراری محسوب می شوند. قابلیت بیش از 150 سویه E.coliO157:H7 ( (E. coli جهت کلونیزاسیون در پرینه و مجاری ادراری و یا مهاجرت آن به دستگاه ادراری به دلیل وجود فاکتور های ویرولانس خاص در این سویه ها است. E. coli دارای 4 تیپ مهم بالینی است که عبارتند از انتروتوکسیژنیک (ETEC)،انتروپاتوژنیک (EPEC)، انترو این وی زیو (EIEC) و انتروهموراژیک (EHEC). تیپ انتروهموراژیک که به دلیل ترشح نوعی

 توکسین، تحت عنوان اشرشیا کلی وروتوکسیژنیک (VTEC) نیز نامیده می شود از عوامل مهم سندروم های خون ریزی دهنده و همولیتیک و همچنین نارسایی های کلیوی متعاقب آن بوده که می تواند در مجاری ادراری و دستگاه گوارشی مشکل ساز باشد. سویه O157:H7 اشرشیا کلی مهم ترین سروتیپ سویه های انتروهموراژیک است كه به عنوان یکی از عمده ترین سویه های بیماری زای انسان معرفی شده و سالانه بروز چندین مورد مرگ و میر از طریق ایجاد عفونت های حاد، خصوصاً با مصرف مواد غذایی آلوده و یا تماس با منابع آلوده را سبب می گردد. همانطور که اشاره شد، سویه های اشرشیا کلی انتروهموراژیک توکسینی ترشح می کنند که به دلیل توانایی آن در کشتن سلولهای vero، وروتوکسین و به دلیل شباهتش به نوروتوکسین مترشحه از شیگلا دیسانتری تیپ I، توکسین شبه شیگا (SLT) نامیده می شود و سویه های تولید کننده آن به STEC نیز معروفند (13). ژن تولید کننده وروتوکسین برروی ژنوم باکتریوفاژ معتدل قرار داشته و توسط تبدیل فاژی به اشرشیا کلی وارد می گردد (13). توکسین های ورو به دو گروه stx1 و stx2 تقسیم بندی می شوند. وروتوکسین با اثر بر روی RNA ریبوزومی سبب ممانعت از سنتز پروتئین ها شده و انواعی از اشرشیا کلی که این سم را تولید می کنند موجب بروز سندروم های خطرناکی از جمله کولیت هموراژیک (HC)، سندروم اورمی همولیتیک (HUS) و به دنبال آن نارسایی های کلیوی خصوصاً در سنین پایین می گردد (17، 18 و 19). شناسایی این سویه ها به دلیل پیچیده بودن، معمولاً به صورت روتین در آزمایشگاه ها انجام نمی پذیرد و پژوهشگران درصدد یافتن روش های ساده برای غربالگری این باکتری ها هستند. از این رو در این مطالعه سعی می شود تا با بررسی های توصیفی – مقطعی، پس از انجام روش های کلاسیک شناسایی و تشخیص باکتری اشرشیا کلی O157:H7، با به کار گیری روش های مولکولی، ضمن تأیید نتایج حاصله در تشخیص، متد های سریع تر و با دقت و حساسیت بالاتر نیز معرفی و ارائه گردد.  

 اهداف اصلی طرح

شیوع ژن های شیگاتوکسین و اینتیمین در سویه های اشریشیاکلی O157:H7 جدا شده از عفونت های ادراری در شهرستان الشتر

اهداف اختصاصی طرح

1)تشخیص مولکولی سویه O157:H7 به روش PCR ومقایسه با تکنیک های کلاسیک تشخیصی

2) بررسی ژن های 1stx, 2stx, eaeA با بهره گرفتن از پرایمرهای اختصاصی به روش PCR

اهداف کاربردی طرح

بررسی فراوانی سویه های O157:H7 EHEC جدا شده از عفونت های ادراری در شهرستان الشتر به منظور اعلام وضعیت شیوع جهت ارائه راهکار های درمانی مناسب در کنترل و یا حذف عامل عفونت خصوصاً در رابطه با عفونت های احتمالی ناشی از سویه O157:H7 اشرشیا کلی

فرضیات یا سئوالات پژوهشی:

چکیده فارسی.. 1

فصل اول مقدمه. 2

1-1-مقدمه ای در مورد سرکه و تاریخچه آن. 3

1-2-مقدمه، خصوصیات و کاربرد های استوباکتر ها و گلوکونوباکتر ها 3

1-3- مقدمه و کاربردهای نانوذرات نقره 3

فصل دوم ی بر تحقیقات گذشته. 6

2-1-مقدمه. 7

2-2-تاریخچه استفاده از نانوذرات… 9

2-3-روش های تولید نانوذرات… 9

2-3-1-تولید فیزیکی.. 10

2-3-2-تولید شیمیایی.. 11

2-3-2-1- سل ـ ژل. 12

2-3-2-2- واکنش حالت‌های جامد ـ مایع. 12

2-3-2-3- چگالش فاز گازی.. 13

2-3-3-تولید بیولوژیکی.. 13

2-4- مکانیسم تولید نانوذرات توسط میکروارگانیسم ها 14

2-5-خواص نانوذرات فلزی نقره 21

2-6- تولید نانوذرات فلزی توسط باکتری ها 22

2-6-1-مثال هایی از تولید درون سلولی نانوذرات فلزی نقره توسط باکتریها 23

2-6-2- مثال هایی از تولید برون سلولی نانوذرات فلزی نقره توسط باکتریها 23

2-7- نانوذرات نقره 27

2-7-1- سمیت نقره 29

2-7-2- خصوصیات، مکانیسم اثر و کاربردهای نانو ذرات نقره 30

2-7-2-1- وسایل درون عروقی مصنوعی.. 33

2-7-2-2- کاتترهای قرار گرفته شده در عروق مرکزی.. 34

2-7-2-3- کاتترهای نوروسرژیکال. 34

2-7-2-4- سیمان استخوان. 35

2-7-2-5- پوشاننده های زخم. 35

2-7-2-6-مهندسی بافت… 37

2-7-2-7-درمان سرطان. 37

2-7-2-8-تشخیص پروتئین ها 37

2-8-پلیمرهای میکروبی.. 38

2-8-1-سلولز. 39

2-9-تاریخچه سلولز. 40

2-10-ویژگی های سلولز. 40

2-11-خواص سلولز. 41

2-12-تجزیه سلولز. 42

2-13-تولیدسلولز. 43

2-14-کاربردهای سلولز وانواع مشتقات آن. 45

2-14-1-مشتقات سلولز. 46

2-14-1-1-نانو بلورهای سلولز. 46

2-14-1-1-1-مشتقات Ncc. 47

2-14-1-1-2-ویژگی ها، خصوصیات و مزایای Ncc. 47

2-14-1-1-3-معایب Ncc. 48

2-14-1-2-کمپلکس سنتز سلولز. 48

فصل سوم مواد و روش ها 49

3-1- مواد و دستگاه ها 50

3-1-1- مواد شیمیایی و محیط های کشت… 50

2-1-2-دستگاه ها و وسایل.. 52

3-2- روش ها و آزمایشات… 53

3-2-1- جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آن ها 53

3-2-1-1- محیط کشت هیسترین اسکرام. 53

3-2-2-انتخاب و شناسایی سویه های باکتریایی.. 54

 

 

3-2-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 54

3-2-2-1-1-رنگ آمیزی گرم. 54

3-2-2-1-2- روش لام مرطوب… 55

3-2-2-1-3-رنگ آمیزی مالاشیت سبز. 55

3-2-2-1-4-آزمون کاتالاز. 55

3-2-2-1-5- آزمون اکسیداز. 55

3-2-2-1-6- آزمون حرکت، ایندول و تولید ( سولفید هیدروژن) (SIM) 56

3-2-2-1-7-آزمون ژلاتین.. 56

3-2-3-بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 56

3-2-3-1-استخراج DNA از میکروارگانیسم ها 56

3-2-3-1-1-تهیه محلول – فنل- کلروفرم- ایزوآمیل الکل.. 56

3-2-3-2-نحوه استخراج DNA از میکروارگانیسم ها 57

3-2-3-2-1-تهیه ژل آگارز 1%. 58

3-2-3-3-پرایمرهای مورد استفاده جهت شناسایی مولکولی باکتری ها 58

3-2-3-4-واکنش زنجیره پلیمراز برای باکتری ها 59

3-2-3-5-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز. 60

3-2-4-خالص سازی سلولز تولیدی.. 60

3-2-4-1- شستشو به وسیله هیدروکسید سدیم. 61

3-2-5-تستهای تایید سلولز. 61

3-2-5-1-هضم آنزیمی.. 61

3-2-5-1-1-آزمون مولیش و بندیکت… 61

3-2-5-2-میکروسکوپ الکترونی نگاره 62

3-2-6- بررسی تولید نانوذرات نقره توسط استوباکترها و گلوکونوباکترها 62

3-2-7-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره 62

3-2-7-1- اسپکتروفوتومتری.. 62

3-2-7-2- پراش اشعه ایکس… 63

3-2-7-3- بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره 63

3-2-8- انتخاب سویه های مناسب جهت ادامه آزمون ها 63

3-2-8-1-تولید نانوذرات نقره درون بستر سلولزی به روش آر-تی.. 63

3-2-9-بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره 63

3-2-9-1-تهیه محلول استاندارد نیم مک فارلند. 64

3-2-10-نگهداری طولانی مدت سویه ها(روش گلیسرول استوک) 64

فصل چهارم نتایج و بحث… 65

4-1-جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آنها 66

4-2-شناسایی سویه های باکتریایی.. 66

4-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 66

4-2-1-1خصوصیات ماکروسکوپی.. 66

4-2-1-2- خصوصیات میکروسکوپی.. 67

4-2-1-3- لام مرطوب… 67

4-2-1-4-رنگ آمیزی مالاشیت سبز. 67

4-3- آزمونهای بیوشیمیایی.. 68

4-4- بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 68

4-4-1- استخراج DNA.. 68

4-4-2- تکثیر توالی 16SrDNA.. 69

4-4-3-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره پلیمراز. 70

4-5-نتایج خالص سازی و شستشو توسط NaOH.. 71

4-6-تستهای تاییدی سلولز. 72

4-6-1-هضم آنزیمی.. 72

4-6-1-1-آزمون مولیش و بندیکت… 72

4-6-2-بررسی میکروسکوپ الکترونی نگاره 72

4-7-بررسی تولید نانوذرات نقره توسط باکتری ها 73

4-8-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره 73

4-8-1-بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره 74

4-8-2-پراش اشعه ایکس… 74

4-8-3- بررسی اسپکتروفتومتری.. 75

4-9-تولید نانوذرات نقره در درون بستر سلولزی به روش آر-تی.. 76

4-10- بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره 76

فصل پنجم نتیجه گیری.. 78

منابع و ماخذ. 89

چکیده انگلیسی.. .

چکیده

فرایند تولید سرکه به لحاظ فیزیولوژیک نوعی واکنش اکسیداسیون ناقص می باشد. از باکتری های تولید کننده سرکه به دو جنس اصلی استوباکتر و گلوکونوباکتر می توان اشاره نمود. این باکتری ها گرم منفی میله ای شکل و هوازی مطلق هستند. توسط تاژه های پری تریش متحرکند، رنگدانه تولید نمی کنند. کاتالاز مثبت هستند و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند. استوباكترزایلینیوس،یکی از باکتریهای مولدسلولزاست. نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است. نانوذرات نقره، یکی از پر کاربرد ترین ذرات در حوزه نانو می باشد و به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه‌، کاربرد فراوان دارد. در این مطالعه، ابتدا 20 سویه از باکتری تولید کننده سلولز از سرکه جداسازی و شناسایی گردید، سپس 5 سویه جهت مطالعات بیشتر انتخاب و DNA آن ها استخراج و واکنش زنجیره پلیمراز( PCR) انجام گردید و نهایتا با بهره گرفتن از پرایمر های اختصاصی تعیین توالی شد. بعد از طی مراحل خالص سازی و تایید لایه سلولزی، تولید نانوذرات نقره توسط باکتری های فوق بررسی و سپس این 5 سویه با توانایی تولید نانوذرات نقره و سلولز تایید شد و نهایتا خواص ضد میکروبی آن ها جهت پوشانندگی زخم ها مورد بررسی قرار گرفت.

کلمات کلیدی :گلوکونوباکتر،استوباكتر، نانوذرات نقره، سلولز

فصل اول

مقدمه

1-1-مقدمه ای در مورد سرکه و تاریخچه آن

قدمت تولید سرکه حاقل به 400 سال قبل از میلاد مسیح می رسد (Deppenmeier, 2002)، و فرایند تولید آن به لحاظ فیزیولوژیک[1]نوعی واکنش اکسیداسیون ناقص می باشد. اولین توصیف درباره تولید سرکه توسط پاستور در سال 1862 انجام گرفت. او دریافت که مادر سرکه توده ای از ارگانیزم های زنده است که عامل اکسیداسیون اتانول به اسید استیک می باشد. باکتری های استوباکتر استی[2] و گلوکونوباکتر سابکسی[3] به ترتیب توسط Beijerink در سال 1898 و De leeuw و Kluyver در سال 1924 توصیف شدند (Moonmangmee, 2000). Asai در سال 1934 و بار دیگر در سال 1968، این باکتری ها را به دو جنس اصلی استوباکتر و گلوکونوباکتر رده بندی کرد (Higgins, 1990). این دو جنس با تغییراتی همچنان بخشی از خانواده استوباکتریاسه را با 12 جنس به خود اختصاص داده اند.

1-2-مقدمه، خصوصیات و کاربرد های استوباکتر ها و گلوکونوباکتر ها

جنس استوباکتر دارای سه گونه می باشد.باکتری گرم منفی[4] میله ای شکل و هوازی مطلق[5] است. در صورت متحرک بودن به وسیله فلاژل های پری تریش[6] متحرک اند(Brenner et al., 2005). این باکتری ها الکل را به آب و کربنیک، لاکتات را به کربنات تبدیل و بعضی از اسید های آمینه را تجزیه می کنند. استوباکترها عموماً در جو تخمیر شده، سرکه و میوه ها و سبزی های ترش یافت می شود. برخی گونه ها مانند استوباکتراستی (A.aceti) اتانول را به اسید استیک، اکسید کرده و کاربرد صنعتی در تولید سرکه دارند،به همین دلیل به استوباکترها، اسید استیک باکتری هم گفته می شوند.این باکتری ها در جوانی گرم منفی و سلول های پیر اکثراً گرم متغییراند. در زیر میکروسکوپ به شکل تک تک، دو تایی و یا به صورت زنجیره دنبال هم مشاهده می شوند. در حین تولید سرکه به هم پیچیده گاه به شکل کوکسی مانند و گاه رشته ای و بلند در می آیند. محیط اسیدی را خوب تحمل می کنند. نسبت به سودوموناس[7] ها تحرک کمتری دارند و رنگدانه تولید نمی کنند. کاتالاز مثبت هستند و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند.این ارگانیسم ها را به دو گروه استوباکترهای با اکسایش شدید[8] که موقتاً ایجاد اسید استیک می نماید و آنرا دوباره تجزیه می کند و استوباکترهای با اکسایش جزئی[9] که اسید استیک تولید شده را دیگر تجزیه نمی کند،تقسیم می نمایند. از گروه استوباکترهای با اکسایش شدید می توان استوباکتر پراکسیدانس[10]، استوباکتر پاستوریانوم[11] و از استوباکترهای با اکسایش جزئی می توان گلوکونوباکتراکسیدانس[12] را نام برد. ما بین این دو گروه باکتریهای استوباکتر گزیلینوم[13] ، استوباکتر استی و استوباکتر اسیدوفیلوم[14] قرار دارند((Garrity, 2002 . این باکتری ها در صنایع غذایی جهت تولید اسید استیک و ویتامین ث اهمیت فراوانی دارند. استوباكتر زایلینیوس، یكى از باكترى هاى مولد سلولز Cellulose است و می تواند گلوكز، گلیسرول و سایر منابع آلی را به سلولز خالص تبدیل كند( and Canon, 1989 Fontana et al., 1991; Williams ). سلولز میكروبى تولید شده توسط استوباكتر زایلینیوس به عنوان یكى از با ارزش ترین پلیمر های زیستی در زمینه هاى گوناگون پزشكى كاربرد دارد.. كاربردهاى متعددى از سلولزمیكروبى در پزشكى، دامپزشكى، صنایع غذایى، نفتى،پوشاكى، آرایشی، بهداشتى و غیره شناخته شده است2001;Kobayashi et al., 2006) ., et al Klemm).

استفاده از سلولز میكروبی براى اولین بار در سال 1980،به عنوان پانسمانى پوشیده شده با مایع برای بهبود زخم انجام گرفت (Klemm et al., 2001) .فونتانا و همكارانش از سلولزمیكروبی، محصولی را با نام بیوفیلم تولید كردند و جهت سوختگی های درجه دوم و سوم، زخم های عمیق، پیوند پوست و به طور كلی برای درمان آسیب های پوستی به كار گرفتند(Fontana et al., 1991 ).

1-3- مقدمه و کاربردهای نانوذرات نقره

نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است( Narayanan and Sakthivel, 2010 ). از میان انواع مختلف نانوذرات، پرکاربردترین آن ها نانوذرات نقره است. نانو ذرات نقره، یکی از پر کاربرد ترین ذرات در حوزه نانو پس از نانو لوله های کربن است، که هر روزه بر کاربرد آن در دنیای نانو افزوده می شود. 
 نانوذرات نقره عمدتاً، به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه‌ای که از خود نشان می‌دهند در مصارف الکترونیکی، نوری، دارویی و بهداشتی و کاتالیتیکی کاربرد فراوان دارند. یکی از دلایل کاربرد گسترده این ذرات ، به دلیل خاصیت آنتی باکتریال این ذرات است و در واقع نانوذرات  نقره برای عوامل بیماری‌زا یک سم تلقی می‌شوند و ‌برای بدن انسان، غذاها و بافت‌ها بی‌ضررند. این در حالی است که نقره به خودی خود فاقد و یا خیلی کمتر این خاصیت است. این خاصیت دوگانه ذرات نانو در مقایسه با ذرات ماکروی نقره به دلیل اثر افزایش سطح در نتیجه افزایش واکنش پذیری ماده و پیروی ماده از فیزیک و شیمی کوانتم[15] در حالت نانو است. خصوصیات نانو ذرات نقره شامل: تاثیر بسیار زیاد، تاثیر سریع، غیر سمی بودن، غیر محرک برای بدن، غیر حساسیت زا، قابلیت تحمل شرایط مختلف (پایداری زیاد)، آب دوست بودن، سازگاری با محیط زیست، مقاوم در برابر حرارت، عدم ایجاد و افزایش مقاومت و سازگاری در میکروارگانیسم می­باشد. نقره در ابعاد بزرگتر، فلزی با خاصیت واکنش دهی کم می باشد، ولی زمانی که به ابعاد کوچک در حد نانومتر تبدیل می شود خاصیت میکروب کشی آن بیش از 99 درصد افزایش می یابد، به حدی که می توان از آن جهت بهبود جراحات و عفونت ها استفاده کرد. نقره در ابعاد نانو بر متابولیسم، تنفس و تولید مثل میکروارگانیسم اثر می گذارد. تاکنون بیش از 650 نوع باکتری شناخته شده را از بین برده است. هر چند این فناوری به تازگی مورد توجه زیادی قرار گرفته و رونق بسیاری پیدا کرده ، اما از آن در طب قدیم استفاده می شده بدون آنکه دلیل تاثیر آن شناخته شود و حتی در جنگ برای کنترل عفونت زخم سربازان از سکه های نقره استفاده می شده است (Rai et al., 2009).

2-1-مقدمه

“نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است. نشانه اختصاری نانو در سیستم متریک n می‌باشد. فناوری نانو یا نانوتکنولوژی رشته‌ای از دانش است که به مطالعه مواد، دستگاه ها و سیستم هادر ابعاد نانو می پردازد و موضوع اصلی آن مهار ماده یا دستگاه‌های در ابعاد کمتر از یک میکرومتر، معمولاً حدود ۱ تا ۱۰۰ نانومتر است. این دانش به فهم و به کارگیری خواص جدیدی از مواد و سیستمهایی در این ابعاد پرداخته که اثرات فیزیکی جدیدی، عمدتا متاثر از غلبه خواص کوانتومی بر خواص کلاسیک، از خود نشان می‌دهند. همچنین موجودات زنده از سلول هایی که به طور معمول دارای طولی حدود 10 میکرومتر است، ساخته می شوند با این حال بخش های درونی سلول ها بسیار کوچک بوده و در اندازه کمترازیک میکرون است.برای مثال کوچکترین پروتئین ها دراندازه معمولی 5 نانومتر می باشند که این اندازه قابل مقایسه باکوچکترین ابعاد نانو ذرات ساخته شده توسط انسان است(Narayanan and Sakthivel, 2010 ).

نانوفناوری یک دانش بین ‌رشته‌ای است و به رشته‌هایی چون فیزیک کاربردی، مهندسی مواد، شیمی ابرمولکول و حتی مهندسی مکانیک، مهندسی برق، مهندسی شیمی و رشته های بیولوژی نیز مربوط می‌شود. تحقیقات در زمینه نانوتکنولوژی به صورت گسترده ای انجام شده و دستیابی به مواد جدیدی در ابعاد نانو مانند نانوذرات، نانولوله ها، نانوسیم ها و … میسر شده است.

در میان این مواد، نانوذرات به دلیل خواص منحصر به فرد خود در خواص شیمیایی، الکترونیکی و مگنتیکی[16] بسیار مورد توجه قرار گرفته اند( Zhang et al ., 2011).

زمینه‌هایی که نانوذرات در آن ها کاربرد دارند، شامل کاربرد نانوذرات در مواد کاتالیزور، کامپوزیت[17]، افزودنی‌های سوخت و مواد منفجره، بسته‌بندی و روکش‌ها، ساینده‌ها[18]، روان‌کننده‌ها، پزشکی و داروسازی، باتری‌ها و پیل‌های سوختی،دارو رسانی، محافظت‌کننده‌ها، آنالیز زیستی و تشخیص پزشکی و لوازم آرایشی می شود. پزشکی نانو، بهره‌گیری از فناوری نانو در امور پزشکی است. این شاخه از پزشکی می‌کوشد تا با بهره گرفتن از فناوری نانو، به تشخیص بیماری‌ها، پیشگیری از آن‌ ها و معالجه بیماران بپردازد. از جمله کاربردهای نانوذرات در زیست شناسی و پزشکی می توان به:شناساگرهای بیولوژیکی فلورسنت[19]

فهرست مطالب صفحه

 

عنوان 1

 

چکیده………………………………………………………………………………………………………………………..  

 

فصل اول: مقدمه و کلیات 2

 

1-1 مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………. 4

 

1-1-1 اهمیت موضوع………………………………………………………………………………………………… 4

 

1-1-2 فرضیات…………………………………………………………………………………………………………. 5

 

1-1-3 اهداف پژوهش………………………………………………………………………………………………… 5

 

1-1-4 ساختارپژوهش………………………………………………………………………………………………… 6

 

1-2 کلیات…………………………………………………………………………………………………………………. 6

 

1-2-1 گیاه شناسی…………………………………………………………………………………………………….. 7

 

1-2-2 رویش و تکثیر گیاه………………………………………………………………………………………….. 7

 

1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار……………………………………………………………………………………. 7

 

1-2-4 نیازهای اکولوژی……………………………………………………………………………………………… 8

 

1-2-5 اهمیت دارویی………………………………………………………………………………………………… 8

 

1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس………………………………………………………………………………… 9

 

1-2-7 استفاده‌ها………………………………………………………………………………………………………… 9

 

1-2-8 کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………………………… 11

 

1-2-8-1 تاریخچه کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………….. 12

 

1-2-9 کاربردهای کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………. 12

 

1-2-9-1 تولید مواد شیمیایی………………………………………………………………………………………. 12

 

1-2-9-2 ایجاد گیاه عاری از عوامل بیماری‌زای گیاهی…………………………………………………… 12

 

1-2-9-3 ایجاد تنوع ژنتیکی……………………………………………………………………………………….. 12

 

1-2-9-4 کاربرد کشت بافت گیاهی در کشاورزی،باغبانی و جنگل‌داری……………………………. 13

 

1-2-9-5 کاربردهای اقتصادی کشت بافت گیاهی………………………………………………………….. 13

 

1-2-9-6 کاربردهای کشت بافت گیاهی در مهندسی ژنتیک و فناوری زیستی……………………. صفحه

 

عنوان 14

 

1-2-9-7 انواع کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………….. 14

 

1-2-9-8 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت……………………………………………. 15

 

1-2-9-9 نمک‌های غیرآلی…………………………………………………………………………………………. 15

 

1-2-9-10 ویتامین‌ها………………………………………………………………………………………………….. 16

 

1-2-9-11 هورمون‌های گیاهی……………………………………………………………………………………. 16

 

1-2-9-11-1 اکسین‌ها……………………………………………………………………………………………….. 17

 

1-2-9-11-2 سیتوکنین‌ها…………………………………………………………………………………………… 18

 

1-2-9-12 منبع انرژی………………………………………………………………………………………………… 18

 

1-2-9-13 عوامل فیزیکی…………………………………………………………………………………………… 18

 

1-2-9-14 مواد آلی……………………………………………………………………………………………………. 19

 

1-2-9-15 ریزنمونه…………………………………………………………………………………………………… 19

 

1-2-9-16 PH…………………………………………………………………………………………………………. 19

 

1-2-9-17 آب………………………………………………………………………………………………………….. 20

 

1-2-9-18 آگار…………………………………………………………………………………………………………. 20

 

1-2-9-19 چگونگی انتخاب محیط کشت…………………………………………………………………….. 20

 

1-2-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت……………………………………………………………. 21

 

1-2-10-1 موارد استفاده از ریزازدیادی………………………………………………………………………… 22

 

1-2-11ریشه‌زائی……………………………………………………………………………………………………….. 22

 

1-2-12 تعریف موتاسیون (جهش)………………………………………………………………………………. 22

 

1-2-12-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون………………………………………………………………………. 23

 

1-2-12-2 انواع موتاسیون………………………………………………………………………………………….. 23

 

1-2-12-3 موتاژن……………………………………………………………………………………………………… 24

 

1-2-12-3-1 انواع موتاژن………………………………………………………………………………………….. 24

 

1-2-12-3-2 عوامل شیمیایی جهش‌زا………………………………………………………………………….. 25

 

1-2-12-4 سطوح ایجاد موتاسیون……………………………………………………………………………….. صفحه

 

عنوان 26

 

 

 

1-2-12-5 مواد گیاهی مورد تیمار……………………………………………………………………………….. 26

 

1-2-12-6 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات………………………………………………………………. 26

 

1-2-12-7 هدف موتاسیون مصنوعی……………………………………………………………………………. 27

 

1-2-12-8 موفقیت موتاسیون……………………………………………………………………………………… 27

 

1-2-12-9 اصلاح به روش موتاسیون…………………………………………………………………………… 27

 

1-2-12-10 روش‌های جدید استفاده از موتاسیون…………………………………………………………. 28

 

1-2- 13اسانس گیاهی………………………………………………………………………………………………… 29

 

1-2-13-1روغن‌های اسانس……………………………………………………………………………………….. 30

 

1-2-13-2 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه……………………………  

 

          فصل دوم: ی بر تحقیقات انجام شده 31

 

2-1 اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف…………………………………………………………. 33

 

2-2 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف…………………………….. 38

 

2-3 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….  

 

          فصل سوم: مواد و روش‌ها 40

 

3-1 مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………………….. 40

 

3-2 کشت بافت…………………………………………………………………………………………………………. 40

 

3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت…………………………………………………………………… 41

 

3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو………………………………………………………………………………. 41

 

3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو……………………………………………………………………. 43

 

3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم………………………………………………………………………. 43

 

3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین……………………………………………………………………………. 44

 

3-2-2 تهیه محیط کشت……………………………………………………………………………………………… 45

 

3-2-3 کار در اتاقک کشت بافت………………………………………………………………………………….. 46

 

3-2-4 ضدعفونی وسایل آزمایشگاهی، محیط کشت و مواد گیاهی…………………………………… 46

 

3-2-4-1 ضدعفونی نمونه‌های گیاهی…………………………………………………………………………… صفحه

 

عنوان 46

 

3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه…………………………………………………………………………………….. 47

 

3-2-5 تهیه ریزنمونه…………………………………………………………………………………………………… 47

 

3-2-6 بهینه سازی محیط کشت…………………………………………………………………………………… 47

 

3-2-7 بررسی نمونه‌های کشت شده……………………………………………………………………………. 47

 

3-2-8 بازیافت کشت‌های آلوده…………………………………………………………………………………… 48

 

3-2-9 تیمارهای مورد استفاده……………………………………………………………………………………… 48

 

3-2-9-1 روش تهیه استوک EMS ……………………………………………………………………………. 49

 

3-2-9-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی…………………………………………… 49

 

3-2-9-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه…………………………………………………………. 50

 

3-2-9-4 روش شستشوی تیمارها……………………………………………………………………………….. 50

 

3-3 تهیه مواد گیاهی برای اسانس‌گیری…………………………………………………………………………. 50

 

3-4 آنالیز اجزاء اسانس……………………………………………………………………………………………….. 51

 

3-5 تجزیه داده‌های آماری……………………………………………………………………………………………  

 

         فصل چهارم: نتایج و بحث 52

 

4-1 کشت بافت…………………………………………………………………………………………………………. 55

 

4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه……………………………………………………. 56

 

4-2-1 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی…………………………………….. 56

 

4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی…………………………………………………. 57

 

4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه……………………………………………………………. 57

 

4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه…………………………………………………………… 58

 

4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ……………………………………………………………. 58

 

4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه………………………………………………………….. 59

 

4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه…………………………………………………………….. 60

 

4-2-8 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ…………………………………………………. 60

 

4-3 استخراج اسانس…………………………………………………………………………………………………… صفحه

 

عنوان 60

 

4-3-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس………………………………………… 61

 

4-3-2 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه………………………………………………………. 62

 

4-3-3 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس……………………………………………………………………………  

 

         فصل پنجم: نتیجه‌گیری 63

 

5-1 بحث………………………………………………………………………………………………………………….. 63

 

5-1-1 کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………………………… 64

 

5-1-2 اثرات موتاژن EMS ………………………………………………………………………………………. 68

 

5-2 نتیجه‌گیری………………………………………………………………………………………………………….. 69

 

5-3 پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………… 70

 

فهرست منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………. 74

 

فهرست منابع انگلیسی…………………………………………………………………………………………………. 86

 

چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………

چکیده

بادرنجبویه با نام علمی Melissa officinalis یکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. این پژوهش با قرار دادن ریز نمونه‌های بادرنجبویه به محیط کشت درون شیشه‌ای MS انجام شد و هدف تکثیر گیاه از طریق کشت بافت برای استفاده از تاثیر موثرتر ماده جهش‌زا و بدست آوردن نمونه‌های گیاهی جدید موتانت شده هم از طریق کشت بافت و هم در محیط مزرعه و بررسی تغییرات میزان مواد موثره اسانس موجود در گیاه در اثر ماده جهش‌زای اتیل متیل سولفانات (EMS) می‌باشد. این آزمایش هم بصورت مزرعه‌ای و هم بصورت آزمایشگاهی (کشت بافتی) مورد بررسی قرار گرفت. در تیمارهای آزمایشگاه، سرشاخه‌های رشد یافته در محیط MS بدون هورمون را با غلظت‌های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% EMS و در مدت زمان‌های 24 و48 ساعت اعمال شدند. در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شدند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیک از قبیل طول ساقه، طول ریشه، تعداد جوانه در ساقه، تعداد ریشه رونده جانبی، طول برگ و تعداد برگ در ساقه مورد ارزیابی قرار گرفته و پاسخ معنی‌داری را در سطح 5 درصد نشان دادند این آزمایش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر مرفولوژیک این گیاه دارویی دارد. بهترین نتیجه نیز از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند و تحت تیمار با غلظت 01/0% EMS بودند به‌دست آمد. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متیل سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.

کلمات کلیدی: بادرنجبویه (Melissa officinalis)، کشت درون شیشه‌ای، محیط کشت MS، اتیل متیل سولفانات(EMS)، مواد موثره

1-1 مقدمه:

گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ ها دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند و در بسیاری از نقاط کشور رشد می‌یابند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با بهره گرفتن از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. در حال حاضر در قرن 21، طب گیاهی از جایگاه خاصی برخوردار است به گونه‌ای که در اتحادیه اروپا قوانینی مبنی بر لزوم انجام آزمایشات بالینی برروی گیاهان دارویی همانند داروهای شیمیایی وضع کرده است که بر اساس آن تمام داروهای گیاهی باید مجوز دریافت نمایند. اولین استفاده از گیاهان دارویی در خاورمیانه و مربوط به عصر پارینه سنگی است. شواهد استفاده از گیاهان دارویی توسط انسان به حدود شصت هزار سال پیش می‌رسد.

گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و می‌توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).

در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ ها متعدد می‌باشد که از آن جمله می‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).

یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی[1] است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.

استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند.در سبز فایل، دانشمندان علوم گیاهی با بهره گرفتن از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با بهره گرفتن از بیوتکنولوژی[2] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته[3] و پلی پلوئید[4] را نام برد.

کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای[5] و یا کشت استریل نیز مطرح می‌شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب بیگی و همکاران، 1385؛ سونانداکوماری و همکاران[6]، 2003). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال 1756 توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس[7] در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری[8]، 1994).

اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمایش های وی روی کشت تک سلول ها پیشنهاد گردید (هابرلنت[9]، 1902). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می‌تواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه بادرنجبویه نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچون اتیل متیل سولفانات[10] (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.

1-1-1 اهمیت موضوع

برای انجام کشت بافت بادرنجبویه (Melissa officinalis L) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران[11]، 2011). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای (in vitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال 1976 توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ ها بالا باشد (باقری و صفاری، 1387).

بادرنجبویه به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می‌شود (امیدبیگی ،1386؛ هوشیار قیصر،1388). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره بادرنجبویه صورت گرفته است (رجحان،1362؛ زرگری،1369؛ مومنی وشاهرخی،1377؛ آزادبخت،1378). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت، بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف، مطالعه متابولیت‌های ثانویه ،انتقال ژن و مهندسی ژنتیک برای این گیاه ضرورت دارد.

1-1-2 فرضیات

* کشت بافت یکی از راه‌های سریع در ازدیاد انبوه بادرنجبویه می‌باشد.

* بادرنجبویه در محیط کشت همواره در دسترس برای اعمال هر گونه اعمال تیمار از قبیل جهش می‌باشد.

* ایجاد جهش تا چه میزانی می‌تواند بر روی مواد موثره و میزان اسانس تغییر ایجاد نماید.

1-1-3 اهداف پژوهش

در این پژوهش تلاش می شود اهداف زیر دنبال شود

*آشنایی با تکنیک کشت بافت گیاه دارویی بادرنجبویه و تکثیر آن در داخل شیشه.

* انتخاب بهترین و مناسب‌ترین نوع از انواع مخیط‌های مختلف کشت بافت

* بدست آوردن مقدار قابل توجه گیاه در حال رشد برای اعمال جهش نقطه‌ای در بادرنجبویه.

*بررسی تغییرات در خصوصیات مورفولوژیکی پس از اعمال جهش در گیاه بادرنجبویه.

* بررسی تغییر در میزان مواد موثره گیاه در غلظت‌های مختلف ماده جهش‌زای EMS

1-1-4 ساختار پژوهش

پژوهش حاضر در پنج فصل ارائه شده است. در فصل اول بیان کلی مسئله، هدف پژوهش و دلایل اهمیت موضوع، گیاه شناسی بادرنجبویه و خصوصیات مختلف آن می‌پردازد. همچنین مباحث مربوط به کشت بافت، تاریخچه و کاربرد آن و فاکتورهای موثر در کشت بافت به دقت مورد بررسی قرار می‌گیرد. در ادامه، مطالب مربوط به ایجاد جهش و اسانس‌گیری آن مطرح شده و در این میان به پژوهش‌

 عنوان                                                                                                                      صفحه

چکیده………………………………………………………………………………………………………………………………..     1  

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه ………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-2- محصولات لبنی تخمیری………………………………………………………………………………………………   3

1-3- ماست…………………………………………………………………………………………………………………………   5

1-3-1- تولید ماست…………………………………………………………………………………………………………….   5

1-3-2- مشکلات و معایب ماست و راه حل های اصلاح آن……………………………………………………   6

1-3-2-1- طعم تلخی…………………………………………………………………………………………………………    6

1-3-2-2- طعم ماستی ـ مخمری…………………………………………………………………………………………   6

1-3-2-3-کپک زدگی…………………………………………………………………………………………………………   6

1-3-2-4- ترش شدن ماست………………………………………………………………………………………………..   7

1-4- کشت‌های آغازگر در ماســت……………………………………………………………………………………….   7

1-4-1- کنترل کیفی آغازگرها……………………………………………………………………………………………….. 11

1-4-1-1- آزمایش میکروسکوپی…………………………………………………………………………………………… 11

1-1-1-2- تشخیص آلودگی………………………………………………………………………………………………….. 11

1-4-1-3- تعیین قدرت مایه………………………………………………………………………………………………… 12

1-4-1-4- تشخیص فاژ………………………………………………………………………………………………………   12

1-5 -باکتری‌های الحاقی به کشت‌های آغازگر………………………………………………………………………..   12

1-5-1- جنس لاکتوباسیلوس……………………………………………………………………………………………….   13

1-5-1-1- لاکتوباسیلوس رامنوزوس……………………………………………………………………………………..   14

1-5-1-2- لاکتوباسیلوس پاراکازئی………………………………………………………………………………………..   16

1-5-2- پروپیونی باکتریوم……………………………………………………………………………………………………..   16

1-5-2-1- جنس پروپیونی باکتریوم‌ها…………………………………………………………………………………….   18

1-5-3- باکتری‌های اسیدلاکتیک…………………………………………………………………………………………..   19

1-5-3-1- تأثیر ضدمیکروبی باکتری‌های اسیدلاکتیک……………………………………………………………….   20

1-5-3-2-تأثیر باکتری‌های اسیدلاکتیک در سلامت انسان…………………………………………………………..   21

1-5-3-3-متابولیسم باکتری‌های اسید لاکتیک شیر به عنوان آغازگر…………………………………………….   21

1-5-4-فاکتورهای مؤثر بر فعالیت ضدقارچی باکتری‌های اسید لاکتیک………………………………………   22

1-5-4-1- اثردرجه حرارت و زمان گرمخانه گذاری……………………………………………………………….   22

1-5-4-2- اثرمحیط رشد……………………………………………………………………………………………………..   22

1-5-4-3- اثر فاکتورهای تغذیه ای……………………………………………………………………………………….   22

1-5-4-4- اثر pH………………………………………………………………………………………………………………. 23

1-6- خاصیت ضد میکروبی ماست………………………………………………………………………………………… 23

1-7- استارترهای محافظ……………………………………………………………………………………………………….. 23

1-8- مهمترین محیط‌های کشت ماست………………………………………………………………………………….. 28

1-8-1- مهمترین محیط های کشت باکتری‌های ماست و پروبیوتیک………………………………………..   29

1-8-1-1- MRS agar………………………………………………………………………………………………….     29

1-8-1-2-MRS-bile agar …………………………………………………………………………………………     29

1-8-1-3-St agar …………………………………………………………………………………………………….       29

1-8-1-4- M17 agar………………………………………………………………………………………………….     29

1-8-1-5- M17-lactoe agar……………………………………………………………………………………….     29

1-8-1-6-MRS(5.2) ……………………………………………………………………………………………………     29

1-8-1-7- MRS-sorbitol agar ………………………………………………………………………………….   30

1-8-1-8-NA-salicin agar …………………………………………………………………………………………   30

1-9- مخمرساکارومایسس سرویزیه…………………………………………………………………………………..     31

1-10- نگهدارنده (نایسین، ناتامایسین)………………………………………………………………………………     32  

1-11- اهداف……………………………………………………………………………………………………………………   34

1-11-1- اهداف اصلی………………………………………………………………………………………………………   34

1-11-2- اهداف فرعی……………………………………………………………………………………………………….   34

1-11-3- اهداف کاربردی…………………………………………………………………………………………………     34

فصل دوم: ی بر پژوهش­های انجام شده

2-1- اثر ضدقارچی پروپیونی باکتریوم فرودن ریچی و لاکتوباسیلوس رامنوزوس……………………       36

 

 

2-2- اثر ضدباکتریایی پروپیونی باکتریوم فرودن ریچی و لاکتوباسیلوس رامنوزوس…………………       39  

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- مواد و دستگاه‌ها…………………………………………………………………………………………………..       43

3-1-1- موادمصرفی……………………………………………………………………………………………………..       43

3-1-2-دستگاه‌ها………………………………………………………………………………………………………….       44

3-2- روش های آزمون…………………………………………………………………………………………………….       44

3-2-1- طرح آزمایش وآماده سازی نمونه ها……………………………………………………………………       44

3-2-2- ارزیابی آماری…………………………………………………………………………………………………..     47

3-2-3- روش های اندازه گیری شاخص ها…………………………………………………………………………     47      

3-2-3-1- تعیین قابلیت زیستی باکتری های آغازگرماست و مخمر ساکارومایسز سرویزیه……..     47  

3-2-3-2- اندازه گیریpH……………………………………………………………………………………………..     47

3-2-3-3- مدت زمان گرمخانه گذاری……………………………………………………………………………..     48

3-2-3-4-سنجش اسیدیته قابل تیتر………………………………………………………………………………….     48

3-3- متغیرهای آزمایش……………………………………………………………………………………………………   48

فصل چهارم : نتایج ویافته­ ها

4-1- اثر گذاری باکتر های محافظ بر رشد مخمر…………………………………………………………………   50

4-1-1- شرایط یخچالی…………………………………………………………………………………………………… 50

4-1-2- شرایط محیطی……………………………………………………………………………………………………. 51  

4-2- مقایسه تعداد مخمردر شرایط نگهداری محیطی و یخچالی……………………………………………. 52

4-2-1- مقایسه تعداد مخمر یخچالی و محیطی در کل آزمایش……………………………………………… 52

4-2-2- مقایسه تعداد مخمر یخچالی و محیطی در تیمار شاهد…………………………………………..   53

4-2-3- مقایسه تعداد مخمر یخچالی و محیطی در تیمار FreshQ2…………………………………….   54

4-2-4- مقایسه تعداد مخمر یخچالی و محیطی در تیمار FreshQ4…………………………………….   54

4-2-5- مقایسه تعداد مخمر یخچالی و محیطی در تیمار HOLDBAC-YMB………………………..   55

4-2-6- مقایسه تعداد مخمر یخچالی و محیطی در تیمار HOLDBAC-YMC……………………….   55

4-3- ارزیابی ظاهری تیمارها در طول دوره نگهداری…………………………………………………………   56

4-4- بررسی رشد باکتری های محافظ در دوره نگهداری……………………………………………………   60

4-4-1- شرایط یخچالی…………………………………………………………………………………………………   60

4-4-2- شرایط محیطی………………………………………………………………………………………………….   61

4-5- بررسی رشد باکتری های لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در دوره نگهداری……………………… 62

4-5-1- شرایط یخچالی…………………………………………………………………………………………………. 62

4-5-2- شرایط محیطی…………………………………………………………………………………………………… 63

4-6- بررسی رشد باکتری های استرپتوکوکوس ترموفیلوس در دوره نگهداری……………………….. 64

4-6-1 شرایط یخچالی……………………………………………………………………………………………………… 64

4-6-2- شرایط محیطی…………………………………………………………………………………………………… 65

4-7-5-7- تأثیر فراوانی باكتری محافظ بر فراوانی مخمر در شرایط و زمان های مختلف آزمایش……   66  

4-7-1- شرایط یخچالی………………………………………………………………………………………………….. 67

4-7-2-شرایط محیطی…………………………………………………………………………………………………….. 68

4-8- مدت زمان گرمخانه گذاری………………………………………………………………………………………. 69

5-9- روند تغییرات اسیدیته طی دوره آزمایش…………………………………………………………………….. 69

فصل پنجم: بحث و نتیجه ­گیری

5-1- بررسی نتایج مربوط به اثرگذاری باکتری های محافظ بر رشد مخمر ساکارومایسس سرویزیه…. 72

5-2- بررسی نتایج مربوط به مقایسه تعداد مخمرها در شرایط نگهداری محیطی و یخچالی……………   74

5-3- بررسی نتایج حاصل از ارزیابی ظاهری تیمارها درطول دوره نگهداری ……………………………….   75

5-4- بررسی نتایج مربوط به رشد آغازگرهای محافظ در دوره نگهداری……………………………………….   76

5-5- بررسی نتایج مربوط به رشد باکتری لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس در

دوره نگهداری………………………………………………………………………………………………………………………    77

5-6- بررسی نتایج مربوط به رشد باکتری استرپتوکوکوس ترموفیلوس در دوره نگهداری……………….. 78

5-7- بررسی تأثیر فراوانی باكتری محافظ بر فراوانی مخمر در شرایط و زمان های مختلف آزمایش…… 79

5-8- روند تغییرات اسیدیته طی دوره آزمایش………………………………………………………………………….   79

5-9- نتیجه گیری نهائی………………………………………………………………………………………………………… 80

5-10- پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………….. 80  

• فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………………………. 81
• چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………… 91

چکیده

در این پژوهش اثر آغازگر محافظ YMB HOLDBAC-، HOLDBAC-YMC ،FreshQ2 و FreshQ4 در دمای محیطی (c°25) و دمای یخچالی (c° 4) بر قابلیت زیستی مخمر ساکارومایسس سرویزیه در دوره نگهداری 30 روز مورد بررسی قرار گرفت. شاخص‌های pH، اسیدیته قابل تیتر، تعداد مخمر، آغازگرهای ماست و آغازگرهای محافظ در طول زمان نگهداری اندازه‌گیری شدند. نتایج نشان داد که در میان آغازگرهای مورد بررسی، FreshQ2 بیشترین قابلیت زیستی را در شرایط نگهداری محیطی و یخچالی دارد در حالی که HOLDBAC-YMB کاهش شدید قابلیت زیستی را در ماست طی دوره ماندگاری نشان می‌دهد. اثر آغازگرهای محافظ بر قابلیت زیستی مخمر در شرایط محیطی و یخچالی مشاهده شد و کاهش تعداد مخمر در تیمارهای دارای آغاز گر محافظ قابل توجه بود. در شرایط یخچالی کمترین شمارش سلولی مخمر در ماست حاوی آغازگرFreshQ2 بود ولی در شرایط نگهداری محیطی تفاوت چندانی بین آغازگرهای محافظ در کاهش قابلیت زیستی مخمر مشاهده نشد. اثر فراوانی آغازگر محافظ بر فراوانی مخمر نشان داد در طول دوره نگهداری محیطی و یخچالی، رابطه خطی معنی‌دار و معکوسی بین فراوانی آغازگر محافظ و فراوانی مخمر وجود دارد. شرایط نگهداری محیطی تاثیر چشمگیری بر قابلیت زیستی مخمر، آغازگرهای ماست(استرپتوکوکوس ترموفیلوس، لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس) و تمام آغازگرهای محافظ (لاکتو باسیلوس رامنوسوس، پروپیونی باکتریوم فرودنریچی شرمانی زیرگونه شرمانی، لاکتوباسیلوس کازئی)طی دوره ماندگاری داشت و شمارش سلولی در ماست نگهداری شده در شرایط محیطی بیشتر بود. آغازگرهای محافظ باعث افزایش قابلیت زیستی باکتری‌های استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس شد به طوری که در شرایط نگهداری یخچالی شمارش سلولی لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس در ماست حاوی   FreshQ2 وHOLDBAC-YMC و شمارش سلولی استرپتوکوکوس ترموفیلوس در ماست حاوی HOLDBAC-YMB بیشترین بود.

لغات کلیدی: آغازگرهای محافظ، زمان ماندگاری، قابلیت زیستی، ماست، مخمر

 1-1- مقدمه

شیر حدود 87 درصد آب و 13 درصد مواد جامد دارد. مواد جامد شامل پروتئین، کربوهیدرات، ویتامین های محلول در آب و مواد معدنی است. شیر منبع مهم کلسیم، فسفر، منیزیم، پتاسیم و منبع غنی از ویتامین B2 می‌باشد(گانش،2006).

شیر و فرآورده‌های تخمیری آن با داشتن ویژگی‌های تغذیه‌ای و تکنولوژیکی خاص، به عنوان حاملان باکتر‌ی‌های پروبیوتیک، امروزه هدف تحقیق و توجه بسیار واقع شده‌اند. شیرعلاوه بر ایجاد محیطی مناسب جهت رشد و بقاء باکتری‌های سودمندی موسوم به پروبیوتیک‌ها، با داشتن خواص تغذیه‌ای ویژه خود، فرآورده‌ای با ارزش را به مصرف کننده عرضه می‌کند. از آنجا که شیر و فرآورده‌های تخمیری آن، از زمان های دور به عنوان ناقلین باکتری‌های اسید لاکتیک مورد پذیرش بشر بوده‌اند، کاربرد آن‌ ها به عنوان حامل باکتری‌های پروبیوتیک چندان دور از ذهن نبود و قرار گرفتن این باکتری‌ها در این پایه، مقبولیت مصرف آن را برای مصرف کننده بهبود می‌بخشد (خسروی دارانی و کوشکی،1387؛ شاه،2004؛ هارلاک،2002).

1-2- محصولات لبنی تخمیری

طبق تعریف فدراسیون بین المللی شیر و فرآورده‌های آن (IDF)، شیرهای تخمیری فرآورده‌هایی هستند که از تخمیر شیر به وسیله فعالیت میکروارگانیسم‌های خاص، حاصل می‌شوند. این میکروارگانیسم‌ها باید در هنگام عرضه و مصرف به صورت زنده، فعال و در مقادیر نسبتاً زیاد موجود باشند. در ضمن بعد از تخمیر، جدا شدن فاز نباید در فرآورده مشاهده شود (کاناواجا و کورانا،2007؛ خسروی دارانی و کوشکی،1387).

در شیرهای تخمیری مایع، دامنه pH می‌تواند از 2/3 تا 9/4 متغیر باشد. این نکته قابل توجه است که تفاوت شیرهای تخمیری مایع و ماست پروبیوتیک در متفاوت بودن خواص فیزیکوشیمیایی و رئولوژیکی آن‌ ها است نه در ترکیب کشت پروبیوتیک(مرتضویان و سهراب وندی،1385).

شیرهای تخمیری نظیر ماست، از این جنبه با پنیر متفاوتند که در تولید آنها آنزیم رنین مورد استفاده قرار نمی‌گیرد و حالت قوام ایجاد شده در آنها ناشی از اسیدی شدن شیر توسط باکتری‌های اسید لاکتیک است. ماست امروزه رایج‌ترین و پرمصرف‌ترین محصول لبنی تخمیری است (مرتضوی و صادقی ماهونک،1385؛ کاناواجا و کورانا2007؛ کریتندن و همکاران 2005؛ مهدیان و طاهرانی،2007).

بسیاری از محصولات تخمیری شیر، محتوی میکروارگانیسم‌های زنده می‌باشند. شیر اسیدوفیلوس، ماست و کفیر از شیرهای تخمیری محتوی باکتری‌های اسیدلاکتیک به تنهایی یا به همراه مخمرها و دیگر باکتری‌های تولیدکننده اسید لاکتیک و الکل می‌باشند. در آسیا، بسیاری از شیرهای تخمیری با بهره گرفتن از قارچ‌هایی نظیر آسپرژیلوس، ریزوپوس، موکور، نوروسپورا و موناسکوس تولید می‌شوند. گزارش شده که در شیرهای تخمیری مقدار اسیدفولیک افزایش و مقدار ویتامین B12 کاهش می‌یابد(بونزار و همکاران،2002).

نژاد میکروارگانیسم به‌کار رفته در شیرهای تخمیری روی ویژگی‌های مختلف این محصولات اثرمی‌گذارد. عده‌ای از محققین اثرات فاکتورهای خاص روی ویژگی‌های رئولوژیکی محصولات شیری تخمیری را ارزیابی کردند. نتایج نشان داد که نوع نژاد کشت‌های آغازگر تجاری اثر معنی‌داری روی سختی، چسبندگی و ویژگی صمغی بودن فرآورده نهایی دارد(محبی و همکاران،2002 ؛ بونزار و همکاران،2008).

طبق گزارشات اولیورا و همکاران(2002) در بسیاری از کشورهای آمریکای شمالی، اروپا و شرق آسیا طیف وسیعی از محصولات شیری تخمیری حاوی حداقل cfu/g 106 از بیفیدوباکتریوم‌ها تولید می‌شود. بررسی‌ها نشان داده که مصرف روزانه محصولات شیری تخمیری به مدت حداقل 6 ماه، مقدار لیپوپروتئین با دانسیته بالا(HDL) را افزایش و موجب بهبود نسبت HDL به لیپوپروتئین با دانسیته پائین (LDL) می‌شود(ابرینگر و همکاران،2008؛ کیسلینگ و همکاران،2002).

از مزایای دیگر شیرهای تخمیری، بهبود هضم لاکتوز، جلوگیری از اسهال، تنظیم سیستم ایمنی بدن، کاهش کلسترول خون و اثرات ضد سرطانی می‌باشد.همچنین مشخص گردیده که باکتری‌های موجود در شیرهای تخمیری اثرات آنتی‌اکسیدانی روی انسان دارند(گانش،2006؛ سونگیسپ و همکاران،2005).

سیتوکین‌ها در واکنش‌های بین باکتری‌های اسید لاکتیک و سیستم ایمنی بدن نقش بسیار مهمی ایفا می‌کنند. برخی از گونه‌های پروبیوتیک نظیر لاکتوباسیلوس کازئی، لاکتوباسیلوس رامنوزوس، لاکتوباسیلوس لاکتیس و لاکتوباسیلوس پلنتاروم موجب افزایش سیتوکین‌ها1 می‌شوند(مولر و ورس،2003).

1-3- ماست

ماست یک محصول تخمیر شده لبنی است که از تخمیر شیر به وسیله استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس بولگاریکوس به‌دست می‌آید(کاراساکوپت و همکاران،2008؛ سایتو،2004).

بر طبق تعریف استاندارد، ماست فرآورده منعقد شده‌ای است که از تخمیر اسید شیر پاستوریزه به وسیله باکتری‌های اختصاصی لاکتیک به میزان معین و در درجه حرارت و زمان مشخص به‌دست می‌آید( بینام ،1377).

ماست با بهره گرفتن از افزودن کشت‌های آغازگر لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه باکتری‌های بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس به شیر به‌دست می‌آید(تمیم و مارشال،1997).

فعال سازی هضم گلوسیدها و پروتئین‌ها، سنتز گروه‌های ویتامین B و ویتامین K، اسیدهای مختلف و لذا جلوگیری از گسترش فعالیت باکتری‌های بیماری زا1 ، سنتز آنتی بیوتیک‌ها، جلوگیری از انواع سرطان‌ها، توقف رشد دیسانتری، تولید دوباره باکتری‌های فلور روده‌ای در طول و بعد از درمان با آنتی بیوتیک، بهبود اگزمای پوستی، بهبود زخم ها، تسکین پوست، کمک به مشکلات گاستروانتریت، جبران کمبود ویتامین‌ها، رفع مشکل هضم لاکتوز در افراد مبتلا به عدم تحمل لاکتوز، رفع حساسیت‌های مربوط به شیر، کاهش استرس و اضطراب، بهبود هپاتیت، آنفلوآنزا، سرخک، صرع، تشنج و دیفتری، افزایش جذب فیبرها و تقویت حافظه از مزایای استفاده از ماست می‌باشد(ال ـ وابل و همکاران،2008.،هارلی و همکاران،2008).

1-3-1- تولید ماست

یکی از نکات مهم در تولید ماست، انتخاب مواد اولیه می‌باشد که عمدتاً شامل شیر و شیرخشک است که همین امر ضامن حفظ کیفیت در محصول نهایی است. شیر مورد استفاده باید خالص، تازه و عاری از هرگونه مواد افزودنی و بازدارنده فعالیت باکتری‌های لاکتیکی از جمله آنتی بیوتیک‌ها، باکتریوفاژها و باقی مانده مواد شستشو دهنده باشد. همچنین فاقد اسید لاکتیک بوده و میزان کازئین و پروتئین‌های محلول آن در حد مجاز باشد(استاندارد ملی ایران شماره 164).

خلاصه مراحل تولید ماست شامل استاندارد کردن چربی شیر، استاندارد کردن میزان مواد جامد بدون چربی شیر، هموژن کردن، فرایند حرارتی، پاستوریزاسیون به روش مداوم با اِعمال دمای بالا و زمان کوتاه2، استریلیزاسیون فرادما، تلقیح باکتری‌های آغازگر(استارتر) ماست، فرایند تخمیر، سرد کردن و بسته بندی است(فرهنودی،1377؛ کریم،1386؛تمیم و رابینسون1999).

1-3-2- مشکلات و معایب ماست و راه حل های اصلاح آن

1-3-2-1- طعم تلخی

به‌دلیل افزودن بیش از حد آغازگر و یا به هم خوردن تناسب در باکتری آغازگر ماست حاصل می‌شود که برای رفع آن، اضافه کردن آغازگر در حد 2 درصد وزنی پیشنهاد می‌گردد(خسروی دارانی و کوشکی،1387).

1-3-2-2- طعم ماستی ـ مخمری

این طعم به دلیل آلوده شدن آغازگر و یا آلوده بودن محیط تولید به مخمر بروز می کند که از بین بردن آلودگی از محیط تولید و سالن کشت آغازگر برای رفع این عیب پیشنهاد می‌گردد(خسروی دارانی و کوشکی،1387).

مواد افزودنی مهم­ترین منبع فساد بوده و در حالات شدید، سلامتی مصرف کننده را به مخاطره می‌اندازد. رایج ترین فساد ماست، از طریق مخمرها بوجود می‌آید که این میکروارگانیسم‌ها به همراه مواد افزودنی و معمولاً از طریق میوه، به محصول راه یافته و قند را تخمیر می کنند. مهمترین نشانه این نوع فساد، ایجاد گاز و در نتیجه متورم شدن و گاهی ترک خوردن و شکستن ظروف بسته بندی است. این گونه فسادها در حین باز کردن ظروف بسته بندی از بوی نامطبوع مخمری، قابل تشخیص هستند. ماست‌هایی که به صورت اسپتیک بسته بندی می‌شوند، در شرایط محیطی پایدار بوده و زمان ماندگاری طولانی دارند. این گونه فرآورده‌ها ممکن است مستعد فساد کپکی باشند که این موضوع می‌تواند هم به علت آلودگی پس از فرایند پاستوریزاسیون و هم به دلیل آلوده شدن به گونه‌های مقاوم به حرارت این نوع میکروارگانیسم‌ها باشد که در اثر اضافه کردن میوه به این فرآورده‌ها راه می‌یابند(مرتضوی و همکاران،1389).

چنانچه فرایند حرارتی استریلیزاسیون با دمای بالا در مورد شیر اِعمال گردد، سطح آلودگی میکروبی آن به شدت کاهش می‌یابد(مرتضوی و همکاران،1389).

1-3-2-3-کپک زدگی

اعمال مجازات کورکورانه و بدون التفات به اوضاع و احوال و شرایط موثر در وقوع جرم عملی ناعادلانه و بی‌حاصل و عبث می‌باشد. اشتباه و عدم آگاهی از قوانین یکی از این اوضاع و احوال و شرایط می‌باشد و مجازات متهمینی که در اثر عدم آگاهی و اشتباه مرتکب جرم شده‌اند با عدل و انصاف و یا اهداف موردنظر از اجراء کیفر منافات داشته و اعمال کیفر نسبت به اینگونه متهمین که در واقع مجرم نبوده و جاذبه‌ها و کشش‌های مجرمانه در آنها وجود ندارد خلاف عدالت و انصاف به نظر می‌رسد چرا که می‌توان گفت این‌گونه افراد نیاز به اصلاح و درمان ندارند. اگر اشتباه و جهل را به عنوان علت رافع مسئولیت بپذیریم، بررسی مسئولیت شخص جاهل و اشتباه کننده واجد این اهمیت است که تا حد زیادی نوع جرایم و مجازات‌ها تغییر می‌کند. مثلاً جرایم حدی با قبول اشتباه و جهل به عنوان عامل رافع مسئولیت کیفری از حالت حد خارج می‌شوند و مجازات‌های تعزیری نیز دچار تغییرات می‌شوند. حتی در جرایم مشمول حکم قصاص، مجازات قصاص منتفی می‌گردد ولی اگر به عدم تاثیر جهل و اشتباه بر مسئولیت مرتکب قائل باشیم قاتل مستحق قصاص و مجرم مستحق مجازات خواهد بود. در مجموع نتایج این تحقیق می‌تواند یاری کننده قانون‌گذار در امر قانون‌گذاری در موضوع مطروحه و اصلاح و تغییر و تکمیل قوانین و همچنین موجب اصلاح و تعدیل رویکرد قضات محترم دادگستری در ما نحن فیه باشد.

پرسش‌های تحقیق

– آیا قاعده جهل به قانون رافع مسئولیت کیفری نیست، به طور مطلق در آرای دادگاه‌ها رعایت می‌شود؟

– دادگاه‌ها تا چه اندازه به ادعای جهل به قانون مرتکب توجه نموده و وی را مبری از مسئولیت دانسته و مجازات وی را تخفیف می‌دهند؟

– کدام قسم از اقسام اشتباه و جهل تاثیر بیشتری در رفع مسئولیت کیفری دارند؟

– قاعده جهل به قانون رافع مسئولیت کیفری نیست تا چه اندازه مورد پذیرش تحولات جدید حقوق کیفری بوده است؟

فرضیه‌های تحقیق

– این قاعده به طور مطلق در آرای دادگاه‌ها رعایت نمی‌شود.

– ادعای به جهل به قانون در جرایم مستوجب حد از سوی مرتکب بیشتر از سایر جرایم مورد توجه دادگاه‌ها بوده و مسئولیت کیفری را از مرتکب سلب می کند برخلاف سایر جرایم که کمتر این ادعا مورد قبول و توجه دادگاه‌ها واقع می‌شود.

– به نظر می‌رسد از انواع جهل و اشتباه، جهل به موضوع تاثیر بیشتری در رفع مسئولیت کیفری دارد چرا که فقدان علم به موضوع، مانع از تحقق سوء نیت عام مرتکب می‌شود.

– این قاعده (جهل به قانون رافع مسئولیت کیفری نیست) را نمی‌توان با تحولات حقوق کیفری امروزی مطابقت داد و تحولات جدید حقوق کیفری تمایلی به پذیرش این قاعده ندارد.

روش تحقیق

روش تدوین و تحقیق این رساله به صورت توصیفی و تحلیل از طریق مراجعه مستقیم به منابع کتابخانه‌ای و مطالعه و بررسی پایان نامه‌ها و مقالات مرتبط با موضوع تحقیق بوده است. مطالب مربوط به دقت مطالعه سپس آنچه قابل استفاده بوده یادداشت و مورد استفاده قرار گرفتند.

سازماندهی تحقیق

پایان نامه حاضر مشتمل بر دو فصل میباشد.فصل نخست با عنوان مفاهیم ، اقسام اشتباه و درآمدی بر جایگاه قاعده درء در جرایم مستوجب حد ، از سه مبحث تشکیل شده است. در مبحث نخست در سه گفتار مفهوم اشتباه و مسئولیت کیفری مورد بحث و بررسی واقع و همچنین واژه اشتباه با مفاهیم مشابه مقایسه می گردد. در مبحث دوم در دو گفتار از اقسام اشتباه و تاثیرگذاری آنها بر مسئولیت کیفری بحث می شود. در مبحث سوم با عنوان جایگاه قاعده درء در مسئولیت ناشی از جرایم حدی در سه گفتار پیرامون مبنا و مفهوم قاعده درء ، دلالت قاعده و جایگاه قاعده در قانون جزایی ایران مطالبی عنوان می شود.

در ادامه فصل دوم متشکل از دو مبحث با عنوان جایگاه اشتباه در متون قانونی جرایم حدی و درآمدی بر دلایل تاثیر یا عدم تاثیر آن در مسئولیت کیفری مطرح میشود.مبحث نخست در سه گفتار به جایگاه اشتباه در متون قانونی ایران و در سه قانون 1) حدود و قصاص 2) قانون مجازات اسلامی سابق ( مصوب سال 75) و 3) قانون جدید مجازات اسلامی مصوب اردیبهشت ماه 92 می پردازد.در مبحث دوم نیز در دو گفتار به ادله تاثیر یا عدم تاثیر اشتباه در مسئولیت کیفری پرداخته میشود.

 

 

شایان ذکر است در جمع آوری مطالب این رساله با مراجعه به کتابخانه ها از کتب حقوقی و فقهی و آراء محاکم استفاده گردیده است.

فصل نخست: مفاهیم، اقسام اشتباه و درآمدی بر جایگاه قاعده در جرایم مستوجب حد

در این فصل مفاهیم ، اقسام اشتباه ، مسئولیت کیفری و مفهوم و مبانی قاعده درء و جایگاه آن در قانون جزایی ایران طی سه مبحث مورد شرح و تفصیل واقع میشود.

مبحث نخست : مفاهیم

در این مبحث و در گفتار اول ابتدا به مفهوم لغوی و اصطلاحی اشتباه می پردازیم.سپس در گفتار دوم مفهوم مسئولیت کیفری و ارکان آن مورد بحث و بررسی قرار گرفته و در گفتار سوم واژه اشتباه با مفاهیم مشابهی همچون جهل ، خطا و نسیان مقایسه می شود.

گفتار نخست: اشتباه

1)   مفهوم لغوی

واژه اشتباه در کتب لغت به معنای مانند شدن و یا چیزی یا کسی را به جای چیزی یا کسی گرفتن. شک و شبهه و سهو و خطا و … آمده است.

اشتباه از ریشه شبهه و در لغت به معنای مانند شدن و یا چیزی یا کسی را به جای چیزی یا کسی گرفتن آمده است[1] و آن عبارت است از تصور خلاف انسان از واقع چندانکه امر موهومی را موجود و یا موجودی را موهوم پندارد. معمولاً اشتباه انسان از ناآگاهی و جهل او به امور وقایع مایه می‌گیرد و خود ممکن است از بی‌دقتی و بی‌مبالاتی و نداشتن توجه کامل به امور ناشی شود.

اشتباه در فرهنگ عمید معنا شده است به مانند شدن چیزی به چیز دیگر در نظر انسان، یکی را به جای دیگری گرفتن یا کاری به غلط انجام دادن، پوشیده شدن کار و مانند آن.[2] برخی معتقدند این کلمه در متون فقهی و حقوقی دو کاربرد کاملاً متفاوت دارد یکی در زبان عربی است که معادل شک، بدگمانی و التباس و کاربرد دیگر اشتباه در زبان فارسی در کتب حقوقی و قانون مدنی است که معادل آن در زبان عربی بویژه در کتب حقوقی معاصرین، کلمه «غلط» به کار رفته است، حقوقدانان در تعریف اصطلاحی اشتباه می‌گویند. «اشتباه تصور نادرستی است که آدمی از چیزی دارد …» یا گفته‌اند «اشتباه عبارت است از تصور خلاف واقع از اشیا» و یا «اشتباه عبارت است از تصور خلاف حقیقت و واقعیت انسان از یک شئ»

آنچه از تدقیق در مفاهیم شک، ظن، وهم می‌توان استنباط کرد عبارت از این است که ذاتاً ماهیت آنها مبتنی بر علم است و لو اینکه علم اجمالی باشد، زیرا شخص در حدوث هریک از حالات نفسانی سه‌گانه (وهم، شک، ظن) بین دو یا چند احتمال دچار تردید می‌گردد مثلاً شخص شاک می‌داند که یکی از دو شئ حرام یا حلال است لکن نمی‌داند این احکام بر کدام یک بار می‌شود و در حقیقت به جهل و عدم آگاهی خود التفات و آگاهی دارد و اگر شخص میان اطراف امری به نحو مساوی مردد باشد و نتواند یک طرف را بر دیگری ترجیح دهد گفته شد که دچار شک گردیده است و اگر حالت نفسانی بالاتر از شک بود جانب راجح از دو طرف تردید در ذهن را ظن و جانب مرجوح را وهم می‌گویند. و در هر سه حالت نفسانی شخص مردد علم اجمالی دارد حال آنکه همانطور که اکثر لغویون علی الخصوص متقدمین فن لغت بیان داشته‌اند شبهه عبارت از التباس شدید است به نحوی که شخص مشتبه امر باطل را صحیح و حرام را مباح می‌داند و با حقیقت پنداشتن این داشته غلط به آن ایمان و اعتقاد دارد و با قطع و یقین عمل می‌کند یعنی در مقابل شخص مشتبه دو یا چند احتمال وجود ندارد بلکه یک امر غلطی که ملتبس به صحت یا حرمتی که ملتبس به حلیت است در مقابل او وجود دارد لکن او به صحت و حلیت یقین دارد حال آنکه واقعیت چیز دیگری است فلذا معلوم می‌شود که پایه و اساس شبهه بر جهل استوار است یعنی شخص جاهل است و بر جهل خود هم هیچ التفاتی ندارد و این مفهوم با جهل مرکب که در آن شخص با قطع و یقین و اعتقاد جازم اما غیر واقع نظر بر جواز عملی دارد مطابقت می‌کند. فلذا آشکار می‌شود که باید پذیرفت ماهیت شک و ظن و وهم علم است و صد البته که علم اجمالی نه تفصیلی[3] و ماهیت شبهه جهل و جهل مرکب است.[4]