چکیده فارسی.. 1

فصل اول مقدمه. 2

1-1-مقدمه ای در مورد سرکه و تاریخچه آن. 3

1-2-مقدمه، خصوصیات و کاربرد های استوباکتر ها و گلوکونوباکتر ها 3

1-3- مقدمه و کاربردهای نانوذرات نقره 3

فصل دوم ی بر تحقیقات گذشته. 6

2-1-مقدمه. 7

2-2-تاریخچه استفاده از نانوذرات… 9

2-3-روش های تولید نانوذرات… 9

2-3-1-تولید فیزیکی.. 10

2-3-2-تولید شیمیایی.. 11

2-3-2-1- سل ـ ژل. 12

2-3-2-2- واکنش حالت‌های جامد ـ مایع. 12

2-3-2-3- چگالش فاز گازی.. 13

2-3-3-تولید بیولوژیکی.. 13

2-4- مکانیسم تولید نانوذرات توسط میکروارگانیسم ها 14

2-5-خواص نانوذرات فلزی نقره 21

2-6- تولید نانوذرات فلزی توسط باکتری ها 22

2-6-1-مثال هایی از تولید درون سلولی نانوذرات فلزی نقره توسط باکتریها 23

2-6-2- مثال هایی از تولید برون سلولی نانوذرات فلزی نقره توسط باکتریها 23

2-7- نانوذرات نقره 27

2-7-1- سمیت نقره 29

2-7-2- خصوصیات، مکانیسم اثر و کاربردهای نانو ذرات نقره 30

2-7-2-1- وسایل درون عروقی مصنوعی.. 33

2-7-2-2- کاتترهای قرار گرفته شده در عروق مرکزی.. 34

2-7-2-3- کاتترهای نوروسرژیکال. 34

2-7-2-4- سیمان استخوان. 35

2-7-2-5- پوشاننده های زخم. 35

2-7-2-6-مهندسی بافت… 37

2-7-2-7-درمان سرطان. 37

2-7-2-8-تشخیص پروتئین ها 37

2-8-پلیمرهای میکروبی.. 38

2-8-1-سلولز. 39

2-9-تاریخچه سلولز. 40

2-10-ویژگی های سلولز. 40

2-11-خواص سلولز. 41

2-12-تجزیه سلولز. 42

2-13-تولیدسلولز. 43

2-14-کاربردهای سلولز وانواع مشتقات آن. 45

2-14-1-مشتقات سلولز. 46

2-14-1-1-نانو بلورهای سلولز. 46

2-14-1-1-1-مشتقات Ncc. 47

2-14-1-1-2-ویژگی ها، خصوصیات و مزایای Ncc. 47

2-14-1-1-3-معایب Ncc. 48

2-14-1-2-کمپلکس سنتز سلولز. 48

فصل سوم مواد و روش ها 49

3-1- مواد و دستگاه ها 50

3-1-1- مواد شیمیایی و محیط های کشت… 50

2-1-2-دستگاه ها و وسایل.. 52

3-2- روش ها و آزمایشات… 53

3-2-1- جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آن ها 53

3-2-1-1- محیط کشت هیسترین اسکرام. 53

3-2-2-انتخاب و شناسایی سویه های باکتریایی.. 54

 

 

3-2-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 54

3-2-2-1-1-رنگ آمیزی گرم. 54

3-2-2-1-2- روش لام مرطوب… 55

3-2-2-1-3-رنگ آمیزی مالاشیت سبز. 55

3-2-2-1-4-آزمون کاتالاز. 55

3-2-2-1-5- آزمون اکسیداز. 55

3-2-2-1-6- آزمون حرکت، ایندول و تولید ( سولفید هیدروژن) (SIM) 56

3-2-2-1-7-آزمون ژلاتین.. 56

3-2-3-بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 56

3-2-3-1-استخراج DNA از میکروارگانیسم ها 56

3-2-3-1-1-تهیه محلول – فنل- کلروفرم- ایزوآمیل الکل.. 56

3-2-3-2-نحوه استخراج DNA از میکروارگانیسم ها 57

3-2-3-2-1-تهیه ژل آگارز 1%. 58

3-2-3-3-پرایمرهای مورد استفاده جهت شناسایی مولکولی باکتری ها 58

3-2-3-4-واکنش زنجیره پلیمراز برای باکتری ها 59

3-2-3-5-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز. 60

3-2-4-خالص سازی سلولز تولیدی.. 60

3-2-4-1- شستشو به وسیله هیدروکسید سدیم. 61

3-2-5-تستهای تایید سلولز. 61

3-2-5-1-هضم آنزیمی.. 61

3-2-5-1-1-آزمون مولیش و بندیکت… 61

3-2-5-2-میکروسکوپ الکترونی نگاره 62

3-2-6- بررسی تولید نانوذرات نقره توسط استوباکترها و گلوکونوباکترها 62

3-2-7-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره 62

3-2-7-1- اسپکتروفوتومتری.. 62

3-2-7-2- پراش اشعه ایکس… 63

3-2-7-3- بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره 63

3-2-8- انتخاب سویه های مناسب جهت ادامه آزمون ها 63

3-2-8-1-تولید نانوذرات نقره درون بستر سلولزی به روش آر-تی.. 63

3-2-9-بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره 63

3-2-9-1-تهیه محلول استاندارد نیم مک فارلند. 64

3-2-10-نگهداری طولانی مدت سویه ها(روش گلیسرول استوک) 64

فصل چهارم نتایج و بحث… 65

4-1-جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آنها 66

4-2-شناسایی سویه های باکتریایی.. 66

4-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 66

4-2-1-1خصوصیات ماکروسکوپی.. 66

4-2-1-2- خصوصیات میکروسکوپی.. 67

4-2-1-3- لام مرطوب… 67

4-2-1-4-رنگ آمیزی مالاشیت سبز. 67

4-3- آزمونهای بیوشیمیایی.. 68

4-4- بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی.. 68

4-4-1- استخراج DNA.. 68

4-4-2- تکثیر توالی 16SrDNA.. 69

4-4-3-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره پلیمراز. 70

4-5-نتایج خالص سازی و شستشو توسط NaOH.. 71

4-6-تستهای تاییدی سلولز. 72

4-6-1-هضم آنزیمی.. 72

4-6-1-1-آزمون مولیش و بندیکت… 72

4-6-2-بررسی میکروسکوپ الکترونی نگاره 72

4-7-بررسی تولید نانوذرات نقره توسط باکتری ها 73

4-8-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره 73

4-8-1-بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره 74

4-8-2-پراش اشعه ایکس… 74

4-8-3- بررسی اسپکتروفتومتری.. 75

4-9-تولید نانوذرات نقره در درون بستر سلولزی به روش آر-تی.. 76

4-10- بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره 76

فصل پنجم نتیجه گیری.. 78

منابع و ماخذ. 89

چکیده انگلیسی.. .

چکیده

فرایند تولید سرکه به لحاظ فیزیولوژیک نوعی واکنش اکسیداسیون ناقص می باشد. از باکتری های تولید کننده سرکه به دو جنس اصلی استوباکتر و گلوکونوباکتر می توان اشاره نمود. این باکتری ها گرم منفی میله ای شکل و هوازی مطلق هستند. توسط تاژه های پری تریش متحرکند، رنگدانه تولید نمی کنند. کاتالاز مثبت هستند و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند. استوباكترزایلینیوس،یکی از باکتریهای مولدسلولزاست. نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است. نانوذرات نقره، یکی از پر کاربرد ترین ذرات در حوزه نانو می باشد و به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه‌، کاربرد فراوان دارد. در این مطالعه، ابتدا 20 سویه از باکتری تولید کننده سلولز از سرکه جداسازی و شناسایی گردید، سپس 5 سویه جهت مطالعات بیشتر انتخاب و DNA آن ها استخراج و واکنش زنجیره پلیمراز( PCR) انجام گردید و نهایتا با بهره گرفتن از پرایمر های اختصاصی تعیین توالی شد. بعد از طی مراحل خالص سازی و تایید لایه سلولزی، تولید نانوذرات نقره توسط باکتری های فوق بررسی و سپس این 5 سویه با توانایی تولید نانوذرات نقره و سلولز تایید شد و نهایتا خواص ضد میکروبی آن ها جهت پوشانندگی زخم ها مورد بررسی قرار گرفت.

کلمات کلیدی :گلوکونوباکتر،استوباكتر، نانوذرات نقره، سلولز

فصل اول

مقدمه

1-1-مقدمه ای در مورد سرکه و تاریخچه آن

قدمت تولید سرکه حاقل به 400 سال قبل از میلاد مسیح می رسد (Deppenmeier, 2002)، و فرایند تولید آن به لحاظ فیزیولوژیک[1]نوعی واکنش اکسیداسیون ناقص می باشد. اولین توصیف درباره تولید سرکه توسط پاستور در سال 1862 انجام گرفت. او دریافت که مادر سرکه توده ای از ارگانیزم های زنده است که عامل اکسیداسیون اتانول به اسید استیک می باشد. باکتری های استوباکتر استی[2] و گلوکونوباکتر سابکسی[3] به ترتیب توسط Beijerink در سال 1898 و De leeuw و Kluyver در سال 1924 توصیف شدند (Moonmangmee, 2000). Asai در سال 1934 و بار دیگر در سال 1968، این باکتری ها را به دو جنس اصلی استوباکتر و گلوکونوباکتر رده بندی کرد (Higgins, 1990). این دو جنس با تغییراتی همچنان بخشی از خانواده استوباکتریاسه را با 12 جنس به خود اختصاص داده اند.

1-2-مقدمه، خصوصیات و کاربرد های استوباکتر ها و گلوکونوباکتر ها

جنس استوباکتر دارای سه گونه می باشد.باکتری گرم منفی[4] میله ای شکل و هوازی مطلق[5] است. در صورت متحرک بودن به وسیله فلاژل های پری تریش[6] متحرک اند(Brenner et al., 2005). این باکتری ها الکل را به آب و کربنیک، لاکتات را به کربنات تبدیل و بعضی از اسید های آمینه را تجزیه می کنند. استوباکترها عموماً در جو تخمیر شده، سرکه و میوه ها و سبزی های ترش یافت می شود. برخی گونه ها مانند استوباکتراستی (A.aceti) اتانول را به اسید استیک، اکسید کرده و کاربرد صنعتی در تولید سرکه دارند،به همین دلیل به استوباکترها، اسید استیک باکتری هم گفته می شوند.این باکتری ها در جوانی گرم منفی و سلول های پیر اکثراً گرم متغییراند. در زیر میکروسکوپ به شکل تک تک، دو تایی و یا به صورت زنجیره دنبال هم مشاهده می شوند. در حین تولید سرکه به هم پیچیده گاه به شکل کوکسی مانند و گاه رشته ای و بلند در می آیند. محیط اسیدی را خوب تحمل می کنند. نسبت به سودوموناس[7] ها تحرک کمتری دارند و رنگدانه تولید نمی کنند. کاتالاز مثبت هستند و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند.این ارگانیسم ها را به دو گروه استوباکترهای با اکسایش شدید[8] که موقتاً ایجاد اسید استیک می نماید و آنرا دوباره تجزیه می کند و استوباکترهای با اکسایش جزئی[9] که اسید استیک تولید شده را دیگر تجزیه نمی کند،تقسیم می نمایند. از گروه استوباکترهای با اکسایش شدید می توان استوباکتر پراکسیدانس[10]، استوباکتر پاستوریانوم[11] و از استوباکترهای با اکسایش جزئی می توان گلوکونوباکتراکسیدانس[12] را نام برد. ما بین این دو گروه باکتریهای استوباکتر گزیلینوم[13] ، استوباکتر استی و استوباکتر اسیدوفیلوم[14] قرار دارند((Garrity, 2002 . این باکتری ها در صنایع غذایی جهت تولید اسید استیک و ویتامین ث اهمیت فراوانی دارند. استوباكتر زایلینیوس، یكى از باكترى هاى مولد سلولز Cellulose است و می تواند گلوكز، گلیسرول و سایر منابع آلی را به سلولز خالص تبدیل كند( and Canon, 1989 Fontana et al., 1991; Williams ). سلولز میكروبى تولید شده توسط استوباكتر زایلینیوس به عنوان یكى از با ارزش ترین پلیمر های زیستی در زمینه هاى گوناگون پزشكى كاربرد دارد.. كاربردهاى متعددى از سلولزمیكروبى در پزشكى، دامپزشكى، صنایع غذایى، نفتى،پوشاكى، آرایشی، بهداشتى و غیره شناخته شده است2001;Kobayashi et al., 2006) ., et al Klemm).

استفاده از سلولز میكروبی براى اولین بار در سال 1980،به عنوان پانسمانى پوشیده شده با مایع برای بهبود زخم انجام گرفت (Klemm et al., 2001) .فونتانا و همكارانش از سلولزمیكروبی، محصولی را با نام بیوفیلم تولید كردند و جهت سوختگی های درجه دوم و سوم، زخم های عمیق، پیوند پوست و به طور كلی برای درمان آسیب های پوستی به كار گرفتند(Fontana et al., 1991 ).

1-3- مقدمه و کاربردهای نانوذرات نقره

نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است( Narayanan and Sakthivel, 2010 ). از میان انواع مختلف نانوذرات، پرکاربردترین آن ها نانوذرات نقره است. نانو ذرات نقره، یکی از پر کاربرد ترین ذرات در حوزه نانو پس از نانو لوله های کربن است، که هر روزه بر کاربرد آن در دنیای نانو افزوده می شود. 
 نانوذرات نقره عمدتاً، به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه‌ای که از خود نشان می‌دهند در مصارف الکترونیکی، نوری، دارویی و بهداشتی و کاتالیتیکی کاربرد فراوان دارند. یکی از دلایل کاربرد گسترده این ذرات ، به دلیل خاصیت آنتی باکتریال این ذرات است و در واقع نانوذرات  نقره برای عوامل بیماری‌زا یک سم تلقی می‌شوند و ‌برای بدن انسان، غذاها و بافت‌ها بی‌ضررند. این در حالی است که نقره به خودی خود فاقد و یا خیلی کمتر این خاصیت است. این خاصیت دوگانه ذرات نانو در مقایسه با ذرات ماکروی نقره به دلیل اثر افزایش سطح در نتیجه افزایش واکنش پذیری ماده و پیروی ماده از فیزیک و شیمی کوانتم[15] در حالت نانو است. خصوصیات نانو ذرات نقره شامل: تاثیر بسیار زیاد، تاثیر سریع، غیر سمی بودن، غیر محرک برای بدن، غیر حساسیت زا، قابلیت تحمل شرایط مختلف (پایداری زیاد)، آب دوست بودن، سازگاری با محیط زیست، مقاوم در برابر حرارت، عدم ایجاد و افزایش مقاومت و سازگاری در میکروارگانیسم می­باشد. نقره در ابعاد بزرگتر، فلزی با خاصیت واکنش دهی کم می باشد، ولی زمانی که به ابعاد کوچک در حد نانومتر تبدیل می شود خاصیت میکروب کشی آن بیش از 99 درصد افزایش می یابد، به حدی که می توان از آن جهت بهبود جراحات و عفونت ها استفاده کرد. نقره در ابعاد نانو بر متابولیسم، تنفس و تولید مثل میکروارگانیسم اثر می گذارد. تاکنون بیش از 650 نوع باکتری شناخته شده را از بین برده است. هر چند این فناوری به تازگی مورد توجه زیادی قرار گرفته و رونق بسیاری پیدا کرده ، اما از آن در طب قدیم استفاده می شده بدون آنکه دلیل تاثیر آن شناخته شود و حتی در جنگ برای کنترل عفونت زخم سربازان از سکه های نقره استفاده می شده است (Rai et al., 2009).

2-1-مقدمه

“نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است. نشانه اختصاری نانو در سیستم متریک n می‌باشد. فناوری نانو یا نانوتکنولوژی رشته‌ای از دانش است که به مطالعه مواد، دستگاه ها و سیستم هادر ابعاد نانو می پردازد و موضوع اصلی آن مهار ماده یا دستگاه‌های در ابعاد کمتر از یک میکرومتر، معمولاً حدود ۱ تا ۱۰۰ نانومتر است. این دانش به فهم و به کارگیری خواص جدیدی از مواد و سیستمهایی در این ابعاد پرداخته که اثرات فیزیکی جدیدی، عمدتا متاثر از غلبه خواص کوانتومی بر خواص کلاسیک، از خود نشان می‌دهند. همچنین موجودات زنده از سلول هایی که به طور معمول دارای طولی حدود 10 میکرومتر است، ساخته می شوند با این حال بخش های درونی سلول ها بسیار کوچک بوده و در اندازه کمترازیک میکرون است.برای مثال کوچکترین پروتئین ها دراندازه معمولی 5 نانومتر می باشند که این اندازه قابل مقایسه باکوچکترین ابعاد نانو ذرات ساخته شده توسط انسان است(Narayanan and Sakthivel, 2010 ).

نانوفناوری یک دانش بین ‌رشته‌ای است و به رشته‌هایی چون فیزیک کاربردی، مهندسی مواد، شیمی ابرمولکول و حتی مهندسی مکانیک، مهندسی برق، مهندسی شیمی و رشته های بیولوژی نیز مربوط می‌شود. تحقیقات در زمینه نانوتکنولوژی به صورت گسترده ای انجام شده و دستیابی به مواد جدیدی در ابعاد نانو مانند نانوذرات، نانولوله ها، نانوسیم ها و … میسر شده است.

در میان این مواد، نانوذرات به دلیل خواص منحصر به فرد خود در خواص شیمیایی، الکترونیکی و مگنتیکی[16] بسیار مورد توجه قرار گرفته اند( Zhang et al ., 2011).

زمینه‌هایی که نانوذرات در آن ها کاربرد دارند، شامل کاربرد نانوذرات در مواد کاتالیزور، کامپوزیت[17]، افزودنی‌های سوخت و مواد منفجره، بسته‌بندی و روکش‌ها، ساینده‌ها[18]، روان‌کننده‌ها، پزشکی و داروسازی، باتری‌ها و پیل‌های سوختی،دارو رسانی، محافظت‌کننده‌ها، آنالیز زیستی و تشخیص پزشکی و لوازم آرایشی می شود. پزشکی نانو، بهره‌گیری از فناوری نانو در امور پزشکی است. این شاخه از پزشکی می‌کوشد تا با بهره گرفتن از فناوری نانو، به تشخیص بیماری‌ها، پیشگیری از آن‌ ها و معالجه بیماران بپردازد. از جمله کاربردهای نانوذرات در زیست شناسی و پزشکی می توان به:شناساگرهای بیولوژیکی فلورسنت[19]