1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-1 پرسش اصلی تحقیق………………………………………………………………………………………………….. 4

1-2 فرضیه ها………………………………………………………………………………………………………………… 4

1-3 اهداف تحقیق………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-4 فروکتوزیل ترانسفرازمیکروبی……………………………………………………………………………………… 4

1-5 فروکتان ها……………………………………………………………………………………………………………… 5

1-6 بیوسنتز فروکتام میکروبی……………………………………………………………………………………………. 8

1-7 ساختار فروکتوزیل ترانسفراز………………………………………………………………………………………. 11

1-8 سازماندهی ژنی فروکتوزیل ترانسفراز ها……………………………………………………………………….. 16

1-9 بیان ژنی فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی………………………………………………………………………… 20

1-10نقش بیولوژیکی فروکتوزیل ترانسفراز و فروکتان ها…………………………………………………………. 24

1-11 پیشرفتهای اخیر در تحقیقات بر روی فروکتان ها ………………………………………………………….. 27

فصل دوم : ی بر تحقیقات انجام شده در ایران و خارج از ایران……………………………………..34 _29

1-1 تحقیقات انجام شده در ایران………………………………………………………………………………………. 30

1-2 تحقیقات انجام شده در خارج از ایران…………………………………………………………………………… 30

فصل سوم: مواد و روشها………………………………………………………………………………………………..51_35

3-1 نمونه گیری و استریل کردن نمونه ها…………………………………………………………………………….. 26

3-2 سنجش آنزیم………………………………………………………………………………………………………….. 37

3-3 بررسی مولکولی………………………………………………………………………………………………………. 47

3-3-1 استخراج DNA از ایزوله……………………………………………………………………………………….. 47

3-3-2 آنالیز کیفی و کمی DNA استخراجی………………………………………………………………………… 48

3-3-3 طریقه ساخت بافر………………………………………………………………………………………………… 48

3-3-4 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………. 48

3-3-5 آنالیز کمی………………………………………………………………………………………………………….. 49

3-3-6 واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………. 49

3-3-6-1اجزای واکنش srDNA-PCR16……………………………………………………………………………. 49

3-3-7 آنالیز کیفی محصولات PCR…………………………………………………………………………………… 50

فصل چهارم : نتایج ……………………………………………………………………………………………………. …69 _51

4-1 جداسازی باکتری های مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز…………………………………………………….. 52

4-2 شناسایی فنوتیپی باکتری های مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز……………………………………………. 52

4-3 نتایج استخراج DNA ژنومی………………………………………………………………………………………. 58

4-4 نتایج واکنش srDAN-PCR16……………………………………………………………………………………. 59

4-5 ردیف سازی توالی بدست آمده در بانک ژن…………………………………………………………………… 59

4-6 ردیف سازی توالی بدست آمده در بانک ژن به منظور تعیین گونه باکتری………………………………. 59

فصل پنجم-بحث و نتیجه گیری………………………………………………………………………………………74_69

5-1 نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………… 73

5-2 جمع بندی……………………………………………………………………………………………………………… 73

5-3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………… 74

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………… 75

چکیده فارسی

فروکتوزیل ترانسفراز های میکروبی، پلی مرهایی هستند که در بیوسنتز فروکتان میکروبی (لوان، اینولین، و اولیگوساکارید-قندمیوه ای) ، نقش دارند واز نظر ساختاری، فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی، دامنه ی کاتالیزوری خانواده ی گلیکوزید هیدرولیز 68 را به اشتراک می گذارند و در هفت گروه که از نظر فیلوژنتیک به هم مربوط می شوند، گروه بندی می گردند. فروکتوزیل ترانسفراز های میکروبی از باکتریهای گرم مثبت- گرم منفی و قارچ ها جدا شده اند. فروکتوزیل ترانسفراز دارای وزن مولکولی 480 کیلو دالتون می باشد. بروز ژن فروکتوزیل ترانسفراز ، عمدتا توسط سیستم های دوجزئی یا مکانیزم های فسفریلاسیون تنظیم می شوند که به دسترسی سوکرز یا سایر سیگنال های محیطی پاسخ می دهند. فروکتان های میکروبی، در ایجاد مقاومت در مقابل فشار محیطی مانند بی آبی، جذب مواد غذایی، تشکیل بیوفیلم و عوامل ویرولانس، نقش دارند.فروکتوزیل ترانسفراز سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده های مختلف مانند آب در واکنش هیدرولیز سوکروز، گلوکز در واکنش تبادل، سوکروز یا فروکتان در پلی مریزاسیون استفاده می کند .هدف از انجام این تحقیق جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری های مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز از نمونه های محیطی بوده است. به این منظور برای بررسی باکتری های مولد آنزیم فوکوزیل ترانسفراز(لوان سوکراز) از منابع محیطی نظیر پوست پرتقال، ضایعات لیمو، ضایعات موز، سبوس گندم و خاک استفاده شد. پس از تهیه سوسپانسیون و ته نشینی ذرات سوپرناتانت حاصل روی محیط های کشت NA و MC کشت داده شد. پلیت ها به مدت 48 تا 72 ساعت در دمای 30 درجه انکوبه و سپس کلنی های حاصل با روش های متداول و استاندارد باکتری شناسی شناسایی و تعیین هویت گردیدند.سنجش آنزیم فوکوزیل ترانسفراز(لوان سوکراز) براساس متد Yanase و همکاران(1992) مورد سنجش و ارزیابی قرار گرفته و غلظت گلوکز آزاد شده با فعالیت آنزیمی توسط کیت گلوکز ارزیابی شد. پس از شناسایی باکتری های مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز با روش بیوشیمیایی سویه هایی که بیشترین فعالیت آنزیمی را داشتند با روش PCR شناسا یی و ایزوله های برتر با روش 16srDNA نیز ارزیا بی و تعیین هویت گردیدند. نتایج نشان داد بهترین و بیشترین میزان تولید آنزیم در 24 ساعت ،طول موج 500 نانومتر و 37 درجه سانتیگراد به میزان آنزیم توسط باکتری های باسیلوس. تورنجنسیس 45/38mg/dl،آرتروباکتر. نیکوتینا36/62mg/dl، باسیلوس . سرئوس46/08mg/dl بوده است. بنابراین مطالعه حاضر نشان داد که نمونه های محیطی حاوی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز می باشد.

کلید واژه: آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز، باکتری های مولد، منابع محیطی، جداسازی و شناسایی مولکولی

1. مقدمه

لوان یا پلی فروکتوز اگزوپلی ساکارید متشکل از واحد های فروکتوزی است(ارناندز و همکاران،2005) [1] که دارای وزن مولکولی 107 دالتون و حدودا از 1470000 واحد فروکتوز تشکیل شده است که در اثر آنزیم لوان سوکراز در خارج از سلول باکتری تولید میشود(آلرگر و همکاران،2006)[2]. گیاهان گلدار لوان را در واکوئل های خود به عنوان منبع قندی برای سازگاری با شرایط سرما و خشکی ذخیره می شود اما در باکتری ها نقش تامین کننده منبع انرژی را ایفا می کند.(با نگئولا و همکاران،2006)[3] برخی باکتریها از قند سوکروز به عنوان منبع کربن استفاده میکنند و در نتیجه قادر به تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفرازهستند(شاشیکالا و همکاران،2001)[4].آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز دارای 2 سوبسترا 2،6 بتا – دی فروکتوزیل و سوکروز است که طی واکنش گلیکوزیل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 2،6 بتا – دی فروکتوزیل را تولید می کند(شاشیکالا و همکاران،2001).

   آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز یک آنزیم خارج سلولی با وزن مولکولی 480 دالتون که سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده ها از جمله ساکاروز ،آب و پلیمر فروکتان می شود(شاشیکالاوهمکاران،2001؛با نگئولا و همکاران، 2006؛ارناندز و همکاران،2005). فعالیت این آنزیم در گستر ه های از فرایند ها شامل بقای باکتری در خاک (باسیلوس سوبتلیس) فتو پاتوژنسیس (اروینیا و سودوموناس) همزیستی (باسیلوس پلی میکسا) و متابولیسم فروکتان در گیاهان است(هرناندز و همکاران،1995) [5]. این آنزیم در باکتریهایی همچون ژئو باسیلوس استرئوترموفیلوس ،باسیلوس سرئوس،لاکتو باسیلوس رئوتری،لوکونوستوک مزانتروئید،استرپتوکوکوس سالیویروس، باسیلوس پلی میکسا ومخمرهای همچون آسپرژیلوس و رودوترولا و قارچ تولید می شود(بنتینگ و همکاران،2001)[6]. این آنزیم در صنایع مواد غذایی و داروسازی و همچنین در تشخیص بیماری دیابت و پاتوژنز بیماری پریودنتال استفاده می شود (پابست و همکاران، 1997؛ آلگر وهمکاران، 2004) [7].

در این تحقیق استفاده از نمونه های محیطی نه تنها سبب استخراج آنزیم مورد نظر بلکه هم در وقت و هم در هزینه صرفه جویی می شود و راندمان تولید به مراتب بیشتر خواهد شد.

1-1 پرسش اصلی تحقیق

1. آیا امکان جداسازی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز از نمونه های محیطی وجود دارد؟
2. آیا باکتریهای استخراج شده آنزیم مورد نظر را دارند؟
3. آیا پتانسیل مناسبی جهت تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز در باکتریهای محیطی وجود دارد یا خیر؟

1-2 فرضیه ها

1.پتانسیل تولید آنزیم ترانسفراز در باکتریهای محیطی در حضور بقایای گیاهی وجود دارد.

2.میزان تولید آنزیم بسته به میزان سوبسترا و دمای محیط متفاوت است

1-3 اهداف تحقیق

1.جداسازی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسقراز ازنمونه های محیطی

2.شناسایی مولکولی و تعیین سکانس ایزوله های موثر در تولید آنزیم

3.هدف کاربردی : ایجاد دانش فنی تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز

1-4 فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی

فروکتوزیل ترانسفراز های میکروبی، پلی مرهایی هستند که در بیوسنتز فروکتان میکروبی (لوان، اینولین، و اولیگوساکارید-قندمیوه ای) ، نقش دارند) هرناندز و همکاران،2008) [8]. از نظر ساختاری، فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی، دامنه ی کاتالیزوری خانواده ی گلیکوزید هیدرولیز 68 را به اشتراک می گذارند و در هفت گروه که از نظر فیلوژنتیک به هم مربوط می شوند، گروه بندی می گردند(هرناندز و همکاران،2008). ژن های کدگذاری شده ی فروکتوزیل ترانسفراز در اپرون ها یا گروه های مرتبط با سایر ژن هایی سازمان دهی می شوند که به ترشح متابولیسم کربوهیدرات یا فروکتوزیل ترانسفراز ارتباط دارند (هرناندز و همکاران،2008).بروز ژن فروکتوزیل ترانسفراز ، عمدتا توسط سیستم های دوجزئی یا مکانیزم های فسفریلاسیون تنظیم می شوند که به دسترسی سوکرز یا سایر سیگنال های محیطی پاسخ می دهند(هرناندز و همکاران،2008). فروکتان های میکروبی، در ایجاد مقاومت در مقابل فشار محیطی مانند بی آبی، جذب مواد غذایی، تشکیل بیوفیلم و عوامل ویرولانس، نقش دارند(اهرناندز و همکاران،2008). در نتیجه اهمیت صنعتی و بیولوژیکی فروکتان ها، فروکتوزیل ترانسفراز ، موضوع تحقیقات فراوانی بوده است که برای بهبود فعالیت آنزیمی یا مشخص کردن نقش بیولوژیکی آنها در طبیعت، انجام شده اند(هرناندز و همکاران،2008).

   لوان سوکراز ( سوکروز 2,6 β-D فروکتان 6, β-D فروکتوزیل ترانسفراز)،از باکتریهای گرم-مثبت همچون باسیلوس.سابتیلیس، باسیلوس.ناتو،باسیلوس.پلی میکسا، باسیلوس. استرپتوکوکوس. موتانس، استرپتوکوکوس. سالیواروس، اکتینومایسس.ویسکوس،اکتینومایسس.نیوزلندی وگرم-منفی همچون اروینیا. آمیلوورا، زایموموناس. موبیلیس، استوباکتر.ساب اکسیداز،گلوکونوباکتر. اکسیداز،پانتوا.آگلومرانس، قارچ های همانند آسپرژیلوس و رودوترولا جدا شده است(دونا و همکاران،1999)[9]. فروکتوزیل ترانسفراز 4 واکنش را کاتالیز میکند،تبدیل،هیدرولیز،ترانسفروکتوزیل،پلیمریزاسیون(هرناندزوهمکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفراز سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده های مختلف مانندآب در واکنش هیدرولیز سوکروز، گلوکز در واکنش تبادل، سوکروز یا فروکتان در پلی مریزاسیون استفاده می کند (شاشیکالا و همکاران،2001). این آنزیم دارای 3 ویژگی 1: سنتز لوان از سوکروز از طریق واکنش ترانس فروکتوزیلاسیون 2: هیدرولیز لوان به مونوساکارید فروکتوز 3: تبدیل فروکتوز به گلوکز (شاشیکالا و همکاران،2001).

فروکتوزیل ترانسفراز دارای 2 سوبسترا سوکروز و 6,2 β-D فروکتوزیل که طی واکنش گلیکوزیل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 6,2 β-D فروکتوزیل را تولید می کند(شاشیکالا و همکاران، 2001). این آنزیم دارای وزن مولکولی 480 کیلو دالتون است و فعالیت این آنزیم در گستره های از فرایندهایی شامل بقای باکتری در خاک (باسیلوس.سابتیلیس) فتوپاتوژنسیس (اروینیا و سودوموناس) همزیستی (باسیلوس .پلی میکسا) و متابولیسم فروکتان در گیاهان است (هرناندز و همکاران،1995).

1-5 فروکتان ها

فروکتان های میکروبی، از باکتری های گرم-مثبت و گرم-منفی، قارچ های خانواده ی آسپرژیلوس[10] و رودوترولا[11]، جدا شده اند(دونا و همکاران،1999). چندین تحقیق خوب در مورد متابولیسم فروکتان گیاهان و نقش فیزیولوژیکی آنها، نقش های سودبخش به عنوان پروبیوتیک ها در تغذیه انسان و حیوان، کاربردهای صنعتی و بیوسنتزدر گیاهان ترانس ژنتیک، تا کنون به چاپ رسیده اند( هان،1990؛ویجن و اسمیکنز،1999؛دلزن و همکاران، 2005)[12]. فروکتان ها بر طبق نوع اتصالی که زنجیره ی فروکتوزیل β-D گسترده شده با سوکرز تشکیل می دهد، به عنوان اینولین ها، لوان ها(فلینز در گیاهان)، لوان های ترکیبی(گرامینان در گیاهان) و سریهای جدید(اینولین جدید و لوان جدید در گیاهان)، طبقه بندی می شوند(شکل 1) (هرناندز و همکاران،2008). اینولین ها، پلیمرهای خطی از فروکتوز با اتصال هستند( فاوکیا و همکاران،2009)[13]. افزودن باقی مانده های فروکتوزیل در اتصال به سوکرز، منجر به تشکیل کستوز-1 می شود که یک اینولین اولیه می باشد(هرناندز و همکاران،2008). پلیمرهای اینولین گیاهی، درجه ای از پلی مریزاسیون(DP)30 تا 150 باقی مانده های فروکتوزیل را دارند درحالی که اینولین های میکروبی، DP معادل با 20 تا 10000 را دارا هستند (هیجوم و همکاران،2006)[14]. لوان ها نیز پلیمرهای خطی از فروکتوز هستند اما با اتصالات (هرناندز وهمکاران، 2008). لوان دارای وزن مولکولی 107 کیلو دالتون و حدودا از 1470000 واحد فروکتوز تشکیل شده است که در اثر آنزیم لوان سوکراز در خارج از سلول باکتری تولید می شود(خنافری و همکاران، 1389).گیاهان گلدار لوان را در واکوئل های خود به عنوان منبع قندی برای سازگاری با شرایط سرما و خشکی ذخیره میکنند اما در باکتری ها نقش تامین کننده منبع انرژی را ایفا می کند( خنافری و همکاران 1389). افزودن باقی مانده فروکتوزیل به سوکرز با اتصال ، منجر به تشکیل کستوز-6 می شود که اولین ماده ی واسطه بیوسنتز لوان می باشد(هرناندز و همکاران،2008). لوان هایی که مبدائ گیاهی دارند(فلین ها)DP کوچکتر از 100 برای باقی ماندهی فروکتوزیل دارند، درحالی که لوان های میکروبی، DP بزرگتر از 100 دارند(هرناندز و همکاران 2008). لوان های ترکیبی(گرامیان ها)، ریشه ی گیاهی دارند و دارای باقی مانده ی فروکتوزیل متصل شده ی و می باشند (هرناندز و همکاران، 200). پیشگام لوان های ترکیبی، تتراساکارید بیفرکوز می باشد(شکل1) (هرناندز و همکاران،2008). در سری های جدید اینولین، واحدهای فروکتوزیل β-D، همانند اینولین، توسط اتصال به هم وصل شده اند، اما زنجیره های فروکتوزیل، به C1 یا C2 از نیمه گلوکزی سوکرز متصل هستند( لویس 1933)[15]. چنین اتفاقی برای سری های جدید لوان نیز رخ می دهد که در آن، واحدهای فروکتوزیل β-D، توسط یک اتصال به هم وصل شده اند و زنجیره های فروکتوزیل به C1 یا C6 از نیمه گلوکزی سوکرز، متصل هستند (هرناندز و همکاران،2008). چون سوکرز پیشگامِ همه ی انواع فروکتان ها می­باشد، آنها اغلب در یک سمت، نیمه گلوکزی دارند(هرناندز و همکاران،2008). زنجیره ی کوچک اولیگوساکاریدها (DP )، اولیگوفروکتوزید، فروکتواولیگوساکارید(FOS) یا زنجیره ی کوتاه FOS نام دارند(هرناندز و همکاران،2008).

 شکل 1-1 طبقه بندی انواع فروکتان ها بر اساس نوع اتصال زنجیره β-D فروکتوزیل با سوکروز( هرناندز و همکاران 2008)

 1-6 بیوسنتزفروکتان میکروبی

گیاهان حداقل به دو فعالیت آنزیمی مجزا احتیاج دارند تا واکنش های اولیه و مدت دار در بیوسنتزرا کاتالیز کنند(هرناندز و همکاران،2008). در مقابل، بیوسنتز فروکتان ها، نیازمند یک فعالیت فروکتوزیل ترانسفراز برای هردو واکنش می باشد(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفرازهای بر طبق روال روبرو دسته بندی شده اند: (1)نوع اتصال میان واحدهای فروکتوزیل β-D در پلیمر که سنتز می کنند (2) ویژگی آنزیمی خود(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفرازهای ، یک باقی ماندهی فروکتوزیل را به یک مولکول پذیرنده ی سوکرز انتقال می دهند که این عمل بر طبق واکنش کلی می باشد:

O- β – D – fructofuranosyl – (2 – 1)- -αD-glucopyranoside +) β -D- fructofuranosyl -( n

– β -D-fructofuranosyl-(2 -1)- -α-D-glucopyranoside) = o- -α D – glucopyranoside – + (β -D

-fructofuranosyl–( n+1 – β – D – fructofuranosyl-(2 – 1)- -αD- glucopyranoside