چکیده 1

فصل اول: مقدمه و کلیات

1-1- مقدمه و کلیات………………………………………………………………………………………………………………………….. 3

فصل دوم: پیشینه تحقیق

2-2- گیاه ذرت………………………………………………………………………………….. 6

2-1-1 تاریخچه و اهمیت ذرت………………………………………………………….. 6

2-1-2- گیاهشناسی ذرت……………………………………………………………………………. 7

2-2- بیماری پوسیدگی فوزاریومی بلال…………………………………………………. 8

2-2-1- تاریخچه، پراکنش و اهمیت بیماری…………………………………………………….. 8

1-2-2- قارچ عامل پوسیدگی فوزاریومی بلال…………………………………………………………………………. 9

2-2-3- روش های شناسایی عوامل بیماری………………………………………………………………………………….. 11

الف) شناسایی بر اساس ویژگیهای مورفولوژیكی………………………………………………………………………… 11

ب) شناسایی بر اساس ویژگیهای بیولوژیكی………………………………………………………………………………. 12

ج) شناسایی بر اساس ویژگیهای مولكولی………………………………………………………………………………….. 12

2-2-4-علائم بیماری………………………………………………………………………………………………………………. 12

2-2-5-زیست‌شناسی عامل بیماری…………………………………………………………………………………………… 13

الف) چرخه بیماری…………………………………………………………………………………………………………………. 13

ب) اپیدمیولوژی…………………………………………………………………………………………………… 14

راه های انتشار……………………………………………………………………………………………………… 15

عوامل موثر در خسارت………………………………………………………………………………… 15

ج- متابولیت‌های ثانویه……………………………………………………………………………………. 16

د) هتروتالیسم………………………………………………………………………………………………………. 20

2-3- كنترل بیماری……………………………………………………………………………………………. 21

2-4- مکانیسمهای مقاومت به بیماری………………………………………………………………………. 23

1) مصونیت Immunity………………………………………………………………………………………………………… 23

2) فرار (Eascape)……………………………………………………………………………………………………………….. 23

3) تحمل (Tolerance)………………………………………………………………………………………………………….. 23

2-5- غربالگری برای ارقام مقاوم به بیماری……………………………………………………………………………………… 24

2-6- ارتباط بین مقاومت ارقام و میزان فومونسین……………………………………………………………………………. 30

فصل سوم: مواد و روشها

3- مواد و روش‌ها………………………………………………………………………………………… 32

3-1- نمونه‌برداری……………………………………………………………………………………….32

3-2- جداسازی، خالص‌سازی و نگهداری جدایه‌ها……………………………………………………………. 32

3-3- محیط کشت‌ها……………………………………………………………………………………. 33

3-3-1- محیط کشت سیب‌زمینی- دکتروز- آگار (P.D.A)………………………………………………….. 33

3-3-2- محیط کشت آب-آگار (W.A) Water Agar…………………………………………………………………… 33

3-3-3- محیط کشت برگ میخک- آگار (CL.A)…………………………………………………………………………… 33

3-3-4- محیط کشت کلرورپتاسیم (KCl)………………………………………………………………………………………. 34

3-3-5- محیط کشت Special Nutrient Agar (S.N.A)…………………………………………………………… 34

3-4- شناسایی گونه‌های فوزاریوم……………………………………………………………………………. 34

3-5- آزمون بیماریزایی……………………………………………………………………………………… 35

3-5-1- آزمون بیماریزایی در گلخانه……………………………………………………………………….. 35

الف- انتخاب جدایه‌ها و کشت بذرهای ذرت در گلخانه……………………………………………………. 35

ب) آماده‌سازی مایه تلقیح و مایه زنی ساقه‌های ذرت……………………………………………………… 35

ج) ارزیابی شدت بیماری (DS)……………………………………………………………………………… 37

3-5-2- آزمون بیماریزائی جدایه‌های F. verticillioides بر روی ساقه در مزرعه……………………….. 37

الف) انتخاب جدایه ها……………………………………………………………………………… 37

ب) تهیه مایه آلوده‌كننده و مایه‌زنی ساقه‌های ذرت……………………………………………………. 37

ج) ارزیابی……………………………………………………………………………………………. 38

3-5-3- آزمون بیماریزایی جدایه‌های F. verticillioides بر روی خوشه در مزرعه………………….. 39

الف: انتخاب جدایه ها…………………………………………………………………………….. 39

ب: تهیه مایه آلوده‌كننده و مایه‌زنی ساقه‌های ذرت…………………………………………………………… 39

ج: ارزیابی شدت بیماری و درصد آلودگی…………………………………………………………………….. 40

 

 

3-6- ارزیابی واكنش مقاومت ژنوتیپ‌های مختلف ذرت نسبت به عامل بیماری در مزرعه……………………. 40

الف) انتخاب جدایه‌ها و ژنوتیپ‌های ذرت…………………………………………………………………….. 41

ب) تهیه مایه آلوده‌كننده و مایه‌زنی بلالهای ذرت………………………………………………………….. 42

ج) ارزیابی شدت بیماری…………………………………………………………………………………………….. 43

3-7- بررسی میزان فومونیسین در ژنوتیپ‌های مختلف ذرت……………………………………………. 44

الف) نمونه‌برداری و آماده‌سازی نمونه‌ها برای آزمون ELISA………………………………………………………. 45

ب) مراحل استخراج فومونیسین كل……………………………………………………………………… 46

ج) انجام آزمون الایزا……………………………………………………………………………………….. 46

د) ارزیابی الایزا……………………………………………………………………………………………………… 47

فصل چهارم: نتایج و بحث

4- نتایج……………………………………………………………………………………………………… 50

4-1- جداسازی و شناسایی گونه‌های فوزاریوم………………………………………………………………. 50

الف) ویژگی‌های جدایه‌های قارچ F. verticillioides (Sacc.) Nirenberg………………………………… 50

ب) ویژگی‌های جدایه‌های قارچ F. proliferatum (Matsushima) Nirenberg………………………. 53

4-2- بررسی بیماریزایی جدایه های قارچ F. verticillioides با روش مایه زنی ساقه در رقم حساس ذرت در گلخانه       55      

4-3- بررسی بیماریزایی جدایه های قارچ F. verticillioides با روش مایه زنی ساقه در مزرعه در روی لاین حساس MO17       57

4-4- بررسی تنوع بیماریزایی جدایه های قارچ F. verticillioides با روش مایه زنی خوشه لاین حساس MO17 در مزرعه       60

4-5- ارزیابی واکنش مقاومت ژنوتیپ های مختلف ذرت نسبت به جدایه های مهاجم قارچ
F. verticillioides در مزرعه در منطقه ساری …………………………………………. 62

4-6- ارزیابی واکنش مقاومت ژنوتیپ های مختلف ذرت نسبت به مخلوط جدایه های مهاجم قارچ
F. verticillioides با دو روش مایه زنی ، تزریق با سرنگ و ایجاد زخم در بلال در مزرعه در منطقه کرج         66

4-7- ارزیابی واکنش مقاومت ژنوتیپ های مختلف ذرت نسبت به جدایه های مهاجم قارچ
F. verticillioides با روش مایه زنی ایجاد زخم در بلال در مزرعه در مناطق کرج و ساری ………………. 72

4-8- بررسی میزان تولید فومونیسین کل در ژنوتیپ های مختلف ذرت …………………. 75

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری

5 – بحث………………………………………………………….. 83

5-1- شناسایی گونه غالب عامل پوسیدگی خوشه ذرت ………………………………. 83

5-2- آزمون های بیماریزایی ………………………………………………………… 84

5-3- آزمون ارزیابی واکنش ژنوتیپ های ذرت به عامل پوسیدگی فوزاریومی بلال ……………………….. 85

5-4- آزمون بررسی تولید میزان فومونیسین کل ……………………………………………… 90

5-5- نتیجه گیری و پیشنهادات ……………………………………………………………………….. 93

منابع و مآخذ ……………………………………………………………………………………………. 95

چکیده

یکی از مهم‌ترین بیماریهای ذرت، بیماری پوسیدگی فوزاریومی بلال (Fusarium ear rot) می‌باشد که دارای پراکنش جهانی است. قارچ عامل بیماری عمدتاً گونه Fusarium verticillioides می‌باشد، که باعث کاهش کمی و کیفی در عملکرد ذرت می‌شود. این بیماری در ایران در مناطق شمالی و ذرت خیز از بیماریهای مهم ذرت به شمار می‌رود.

در سال 1388، به منظور شناسایی عوامل بیماری و تعیین گونه غالب آن، از مزارع مختلف مناطق اصفهان، ساری، کرمانشاه و کرج از بلالهای آلوده نمونه‌برداری صورت گرفت.

پس از جداسازی و خالص‌سازی تعداد 40 جدایه فوزاریوم (32 جدایه F. verticillioides و 8 جدایه
F. proliferatum ( بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و با استناد به کلیدهای معتبر قارچ‌شناسی مورد شناسایی قرار گرفت. بدین ترتیب قارچ F. verticillioides با فراوانی %80 به عنوان گونه غالب عامل بیماری فوق و قارچ F. proliferatume با فراوانی %20 به عنوان گونه دوم عامل بیماری معرفی شدند. بیماریزایی گونه های شناسایی شده طی آزمونهای گلخانه‌ای و مزرعه‌ای به اثبات رسید. نتایج حاصل از آزمایشات بیماریزایی جدایه‌ها نشان داد که جدایه‌های F. verticillioides دارای قدرت بیماریزایی متفاوتی می‌باشند، و در گروه های مختلف قرار گرفتند. نتایج حاصل از این بررسی‌ها نشان داد که بین دو آزمایش گلخانه و مزرعه همبستگی نسبتاً پائینی r=0.45) ( وجود دارد . در این بررسی مقاومت 10 ژنوتیپ مختلف ذرت با دو روش مایه‌زنی، ایجاد زخم در بلال (Nail Punch) و تزریق در نوک بلال (Tip injection) در دو منطقه ساری و کرج مورد ارزیابی قرار گرفت. به منظور این بررسی از مخلوط هشت جدایه برتر
F. verticillioides که در آزمون گلخانه ای بیماریزایی بیشتری داشتند به عنوان مایه تلقیح با غلظت 106 اسپور در هر میلی‌لیتر استفاده شد. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که ژنوتیپ‌ها از نظر حساسیت به بیماری پوسیدگی فوزاریومی بلال با همدیگر متفاوت بوده و لاین K18 در هر دو منطقه در مقایسه با لاین‌ها از مقاومت بهتری برخوردار بوده است. نتایج بررسی تولید مایکوتوکسین فومونیسین کل در ژنوتیپ‌ها ی مختلف ذرت که توسط ELISA در دو منطقه ساری و کرج صورت گرفت، سطوح مختلفی از فومونیسین کل را در بین ژنوتیپ‌های مختلف ذرت نشان داد. نتایج حاصل از بررسی میزان حساسیت به بیماری و میزان تجمع فومونسین حاکی از آن است که مابین مقاومت ژنوتیپ‌ها و میزان تجمع فومونسین رابطه‌ای مستقیم وجود دارد بطوریکه لاین K18 به عنوان ژنوتیپ مقاوم با کمترین میزان فومونیسین   در هر دو منطقه مشاهده گردید .، و لاین K19 به عنوان حساس ترین ژنوتیپ با بیشترین میزان فومونیسین شناخته شد.

کلمات کلیدی: ذرت، شناسایی، فوزاریوم، مقاومت، فومونیسین.

مقدمه و کلیات

ذرت یکی از مهمترین گیاهان زراعی است که در اکثر کشورهای جهان کشت می‌شود. این گیاه به عنوان سلطان غلات معروف است، زیرا ارزش آن در جهان از گندم، جو، یولاف و برنج بیشتر است. ذرت به دلیل داشتن تنوع و کیفیت و عادات رشد مختلف به عنوان یکی از بهترین گیاهان زراعی مورد استفاده قرار می گیرد. ذرت یکی از پرمحصول‌ترین غلات بشمار می‌رود و از لحاظ مقدار کل تولید بعد از گندم و برنج سومین محصول غله‌ای جهان است. تولید غذا برای جمعیت روز افزون جهان مهمترین مشكل جوامع بشری است. غذای اصلی انسان اغلب از فرآورده‌های گیا هان تیره غلات بویژه گندم ،برنج و ذرت تامین می‌گردد.

طبق آمار سازمان خواربار جهانی (FAO) در كشورهای توسعه یافته 78% ازذرت تولیدی برای تغذیه دام وفقط 6% به عنوان غذای انسان استفاده می‌شود و مابقی مصرف صنعتی دارد. در حالیكه در كشورهای درحال توسعه 50% به عنوان علوفه و40% به طور مستقیم صرف تغذیه انسان و باقیمانده آن برای مصارف صنعتی یا جهت بذر به صورت واریته‌های آزاد گرده‌افشان بكار می‌رود (Anonymous, 2006). با توجه به اهمیت ذرت در تغذیه دام و طیور و همچنین قدرت تطابق و سازگاری این گیاه با شرایط اقلیمی متفاوت و استفاده از بذر هیبرید و مكانیزه شدن كشت ذرت طی سالهای اخیر، سطح زیر كشت و متوسط عملكرد آن در واحد سطح در كشور افزایش قابل توجهی پیدا نموده است .اصلاح ذرت در جهت افزایش عملكرد دانه، علوفه سیلویی و مقاومت در برابر آفات و بیماریهای گیاهی بر پایه اصلاح جمعیت‌ها و تولید واریته‌های هیبرید می باشد. در این راستا لازم است صفاتی كه به طور مستقیم و یا غیر مستقیم روی عملكرد موثر هستند شناسایی گردد و نقش هر یک از این صفات در عملکرد مشخص گردد. عوامل متعددی مانند آفات و بیماریها باعث کاهش عملکرد می شوند. پوسیدگی بلال ذرت یکی از مهم‌ترین بیماریهای ذرت در سراسر دنیا بخصوص در مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری می باشد. این بیماری هر ساله علاوه بر خسارات کمی خسارات کیفی نیز به بار می‌آورد. بیماری در مزرعه قادر است تا95% محصول را خسارت بزند
(Jeffere et al., 1994).

بروز این بیماری در قاره‌های امریکا، اروپا، اسیا، افریقا گزارش شده است (MCGee, 1988). در ایران این بیماری در مناطق شمالی کشور مانند گرگان، ساری و بندرانزلی گزارش شده است (مهریان وبامدادیان، 1369). پوسیدگی بلال عمدتاً با دانه‌های آلوده و پراکنده‌ای که با میسلیوم سفید مایل به صورتی پوشیده است مشخص می‌گردد (Farrar & Davis, 1991). در سالهای اخیر نقش این بیماری با توجه به توکسین‌هایی که توسط گونه‌های مختلف F. verticillioides، F. proliferatim،F. moniliforme و Fusarium nyganai تولید می‌شوند در کاهش کیفیت ذرت و ایجاد مسمومیت در انسان و دام نقش ویژه‌ای دارد (Leslie & Summerell, 2006). فومونیسین‌ها گروه خاصی ازمایکوتوکسین‌ها هستند که عمدتاً در ذرت و فراوردهای آن ایجاد می‌شوند. با توجه به اینکه برای مبارزه با هر بیماری شناخت بیمارگر ضروریست و عدم توفیق در کنترل بیماری نتیجه عدم درک و شناخت پاتوژن می‌باشد، بنابراین شناسایی گونه‌های مختلف عامل بیماری و بررسی میزان فومونیسین مترشحه آنها در مدیریت بیماری و تضمین سلامت غذایی مصرف کنندگان بسیار مهم می‌باشد. لذا بررسی دقیق و انجام تحقیق در ارتباط با میزان توکسین قارچ و احتمال کاهش آن با بهره‌گیری از ژنوتیپ‌های مقاوم در مناطق شیوع بیماری ضروری بنظر می‌رسد. یکی از مهمترین راه های کنترل این بیماری و کاهش میزان مایکوتوکسین‌های مضر مترشحه قارچ عامل بیماری، شناسایی و دستیابی به ارقام مقاوم می‌باشد که تنها از طریق آلوده‌سازی به طور مصنوعی در مزارع و طی چند سال بدست می‌آید. در این تحقیق پس از تعیین تنوع بیماریزایی جدایه‌های قارچ عامل بیماری، ژنوتیپ‌های مختلف ذرت از نظر میزان مقاومت به بیماری سنجیده شده و اینکه آیا ارتباطی بین مقاومت به قارچ عامل بیماری و میزان فومونیسین کل تولید شده وجود دارد یا خیر مورد بررسی قرار می گیرد. کاربرد نتایج این تحقیق در برنامه‌های اصلاحی جهت تولید ارقام مقاوم ذرت با میزان فومونیسین پایین و هیبریدهای متحمل به بیماری پوسیدگی فوزاریومی خوشه یا بلال باعث افزایش کمی و کیفی محصول در مزارع زیر کشت خواهد شد و از نظر ارتقای سلامت غذایی در مصرف کنندگان می‌تواند بسیار با اهمیت و ارزشمند باشد. این تحقیق جهت نیل به اهداف عمده زیر طرح‌ریزی و انجام گردید.

1 – شناسایی قارچ عامل پوسیدگی فوزاریومی خوشه ذرت و تعیین گونه غالب عامل بیماری

2- بررسی تنوع بیماریزایی جدایه‌های قارچ عامل بیماری

3- ارزیابی ژنوتیپ‌های ذرت از نظر میزان مقاومت به بیماری

4- ردیابی و تعیین میزان تولید فومونیسین کل در ژنوتیپ‌های مختلف ذرت

5- ارتباط بین میزان تولید فومونیسین کل و میزان مقاومت به بیماری پوسیدگی فوزاریومی ذرت در ژنوتیپ‌های تحت بررسی.

2- ی بر مطالعات انجام شده

2-1- گیاه ذرت

2-1-1 تاریخچه و اهمیت ذرت

ذرت Corn) Maize= ) یکی از کهن‌ترین گیاهان روی زمین می‌باشد. منشاء اولیه ذرت آمریکای مرکزی است (نصیری، 1385). ذرت اصلی‌ترین زراعت جهت تامین مواد غذایی در آمریکای شمالی، مرکزی و جنوبی قبل از کشف قاره جدید بوده است. پژوهشهای باستان‌شناسی در کشور مکزیک مشخص نموده است که ذرت قریب به 450 سال قبل از میلاد در آنجا کشت گردیده است . وجود بوته ذرت در دست
Taloc Aztec خدای باران متعلق به تمدنهای قدیمی مکزیک دلیل کشت آن در زمان های دور است (نورمحمدی، 1376). ذرت نه تنها به عنوان غذای اصلی مردم محسوب می‌گردیده، بلکه نقش و اهمیت بسیار مهمی در زندگی مردم، آداب و مراسم مذهبی و تاریخ مردم در آمریکای جنوبی، مرکزی و شمالی داشته است (نصیری، 1385). وایلوف مبدأ اولیه ذرت را در جنوب مکزیک، آمریکای مرکزی، آمریکای جنوبی، مرکز آمریکای جنوبی (پرو، اکوادور، بولیوی) ذکر می‌کند. در سال 1493 میلادی ذرت از قاره آمریکا توسط کریستف کلمب وارد قاره اروپا گردید و اروپائیان این گیاه را به نام Marisi یا Mahiz که یک نام بومی در سرزمین سرخ‌پوستان بود، نامیدند. اوایل قرن شانزدهم میلادی پرتقالیها ذرت را وارد اندونزی، آفریقا، هندوستان و چین نمودند (نورمحمدی، 1376). کشت آن در قرن هفدهم میلادی رونق گرفت و لینه (Linne )در سال 1737 میلادی نام علمی Zea mays L. را برای آن برگزید (پورصالح، 1373).

کلمه Zea لغتی یونانی است که ریشه آن Zoein به معنی زندگی است Zea (Zeia) به دانه‌های پوشیده بویژه Triticum spelta (گیاه ضروری برای زندگی انسان) لحاظ می‌گردیده است (نورمحمدی، 1376). ذرت حاوی ویتامین A و B1 (تیامین) و ویتامین B6 (ریبوفلاوین) می‌باشد. ریبوفلاوین آن بیشتر از گندم و جود بوده و حدود ppm 02/1 است. همچنین از ذرت در تهیه گلوتن خوراکی- صنایع پلاستیک‌سازی تهیه ورنی- صابون‌سازی- تهیه نشاسته- داروسازی- تهیه غذای کودکان و … استفاده می‌شود. ذرت به دلیل ویژگیهای بسیار زیاد خود، به ویژه به علت قدرت سازگاری خود با شرایط اقلیمی گوناگون، بسیار سریع و در تمام دنیا گسترش یافت و مکان سوم را بعد از گندم و برنج از نظر سطح زیر کشت به خود اختصاص داد (نصیری، 1385).

بر اساس گزارش فائو میانگین تولید دانه ذرت در دنیا طی سالهای 2009-2008 حدود 817 میلیون تن می‌باشد که از این مقدار سهم ایالات متحده آمریکا بعنوان تولیدکننده پیشرو محصول ذرت در دنیا حدود333 میلیون تن می‌باشد. چین و برزیل و مکزیک نیز به ترتیب 163 ، 2/51 و 20 میلیون تن مقامهای بعدی را دارا می‌باشند(Anonymous, 2009). در بین کشورهای تولیدکننده ذرت جهان در سال 2009، ایالات متحده آمریکا با سطح برداشت برابر 29668 هزار هکتار، 4/20 درصد از سطح برداشت جهانی این محصول را بخود اختصاص داده و از این نظر در رتبه نخست جای گرفته است. پس از آن کشور چین با 5/30میلیون هکتار در سطح برداشت جهانی در رتبه دوم و برزیل با 8/13 میلیون هکتار در جایگاه سوم قرار گرفته‌‌اند. به جز کشورهای مکزیک 2/7 میلیون هکتار سطح زیر کشت جهانی، سایر کشورهای تولیدکننده هر کدام سهمی کمتر از 3/2 درصد داشته‌اند.

سطح زیر کشت ذرت در ایران در سال زراعی 88-87 برابر با 234 هزار هکتار طبق برآورد دفتر محصولات زراعی است. استان فارس با 37 درصد از کل سطح زیر کشت ذرت کشور بیشترین سطح را در بین استانها به خود اختصاص داده است. پس از آن خوزستان با 22 درصد سهم در رتبه دوم قرار گرفته است و کرمانشاه نیز با 11 درصد در جایگاه سوم قرار دارد. سه استان ذکر شده مجموعاً 66 درصد سطح زیر کشت محصول مزبور را در کشور به خود اختصاص داده‌اند و از مراکز عمده تولید این محصول به شمار می‌روند. صرف نظر از استان‌های چهارمحال و بختیاری و زنجان که فاقد کشت این محصول در همین سال بوده‌اند، استان سمنان با 32 هکتار کمترین سطح را داشته است.

2-1-2- گیاهشناسی ذرت

ذرت گیاهی است یکساله و یک پایه که گلهای نر و ماده آن در دو گل آذین جدا از دو روی یک بوته قرار دارند بطوریکه گل نر به صورت خوشه‌ای در انتهای ساقه قرار دارد و به آن گل‌آذین نر یا تاسل (Tassel) نیز می‌گویند و گلهای ماده در بلال قرار گرفته‌اند. گرده‌افشانی در ذرت به صورت دگرگرده‌افشانی یا غیرمستقیم (Anemogamie) است و گلهای نر سه روز زودتر شروع به گرده‌افشانی می‌کنند و این امر یک هفته ادامه می‌یابد (پورصالح، 1373). این گیاه از شاخه پیدازدان (Phanerogas)، زیر شاخه نهاندانگان(Angiosperms)، از طبقه تك لپه‌ایها(Monocotyledon)، متعلق به تیره گندمیان (Poaceae=gramineae) ، زیر تیره پانیكوئیده (Panicoideae)، و قبیله آندروپوگونه (Andropogoneae) یا به عقیده برخی از متخصصان از قبیله میدیه(Maydeae) بوده و گیاهی دیپلوئید با بیست كروموزوم(n=2x=20) می‌باشد(پورصالح ، 1373).

2-2- بیماری پوسیدگی فوزاریومی بلال

2-2-1- تاریخچه، پراکنش و اهمیت بیماری

پوسیدگی فوزاریومی خوشه ذرت یکی از مهمترین بیماریهای ذرت در سراسر دنیا به خصوص در مناطق گرمسیری (Tropical) و نیمه گرمسیری (Subtropical) به شمار می‌رود. این بیماری به نامهای پوسیدگی فوزاریومی دانه (Fusarium kernel rot)، پوسیدگی فوزاریومی خوشه (Fusarium ear rot) و پوسیدگی فوزاریومی ساقه و خوشه (Fusarium stalk and ear rot) معروف می‌باشد