فهرست مطالب صفحه

 

عنوان 1

 

چکیده……………………………………………………………………………………………………………………………  

 

فصل اول: مقدمه و کلیات 2

 

1-1 مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………….. 3

 

1-1-1 اهمیت موضوع……………………………………………………………………………………………………. 4

 

1-1-2 فرضیات……………………………………………………………………………………………………………… 4

 

1-1-3 اهداف پژوهش……………………………………………………………………………………………………. 5

 

1-2 کلیات…………………………………………………………………………………………………………………….. 5

 

1-2-1 گیاه شناسی…………………………………………………………………………………………………………. 6

 

1-2-2 نیازهای اکولوژی…………………………………………………………………………………………………. 6

 

1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار……………………………………………………………………………………….. 7

 

1-2-4 خواص دارویی……………………………………………………………………………………………………. 7

 

1-2-5 موارد استفاده………………………………………………………………………………………………………. 8

 

1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس…………………………………………………………………………………….. 8

 

1-2-7 کشت بافت…………………………………………………………………………………………………………. 9

 

1-2-7-1 انواع کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………………… 10

 

1-2-7-2 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت………………………………………………… 10

 

1-2-7-3 نمک‌های غیرآلی……………………………………………………………………………………………… 11

 

1-2-7-4 ویتامین‌ها……………………………………………………………………………………………………….. 11

 

1-2-7-5 منبع انرژی……………………………………………………………………………………………………… 11

 

1-2-7-6 میواینوسیتول…………………………………………………………………………………………………… 12

 

1-2-7-7 عوامل فیزیکی…………………………………………………………………………………………………. 12

 

1-2-7-8 ریزنمونه…………………………………………………………………………………………………………. 12

 

1-2-7-9 چگونگی انتخاب محیط کشت………………………………………………………………………….. 13

 

1-2-7-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت…………………………………………………………… 13

 

1-2-7-11ریشه‌زائی………………………………………………………………………………………………………. 14

 

1-2-8 تعریف موتاسیون (جهش) …………………………………………………………………………………… صفحه

 

عنوان 14

 

1-2-8-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون……………………………………………………………………………. 15

 

1-2-8-2 سطوح ایجاد موتاسیون…………………………………………………………………………………….. 15

 

1-2-8-3 انواع موتاسیون………………………………………………………………………………………………… 16

 

1-2-8-4 موتاژن (عامل جهش‌زا) …………………………………………………………………………………… 16

 

1-2-8-4-1 انواع موتاژن……………………………………………………………………………………………….. 16

 

1-2-8-4-2 عوامل شیمیایی جهش‌زا……………………………………………………………………………….. 18

 

1-2-8-4-3 مواد گیاهی مورد تیمار…………………………………………………………………………………. 18

 

1-2-8-4-4 اصلاح به روش موتاسیون…………………………………………………………………………….. 19

 

1-2-8-4-5 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات. ………………………………………………………………. 19

 

1-2-8-4-6 موفقیت موتاسیون……………………………………………………………………………………….. 19

 

1-2-8-4-7 روش‌های جدید استفاده از موتاسیون…………………………………………………………….. 20

 

1-2-8-4-8 هدف موتاسیون مصنوعی……………………………………………………………………………… 21

 

1-2-9 روغن‌های اسانس………………………………………………………………………………………………… 22

 

1-2-9-1 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه…………………………………  

 

          فصل دوم: ی بر تحقیقات انجام شده 23

 

2-1 کشت بافت…………………………………………………………………………………………………………….. 24

 

2-2 اثر موتاژن‌ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف……………………………………………………………… 26

 

2-3 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف…………………………………  

 

          فصل سوم: مواد و روش‌ها 32

 

3-1 مواد گیاهی……………………………………………………………………………………………………………… 32

 

3-2 کشت بافت…………………………………………………………………………………………………………….. 32

 

3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط‌های کشت………………………………………………………………………. 33

 

3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو………………………………………………………………………………….. 34

 

3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو……………………………………………………………………….. 34

 

 

 

3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم………………………………………………………………………….. 35

 

3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین……………………………………………………………………………….. 35

 

3-2-2 تهیه محیط کشت…………………………………………………………………………………………………. صفحه

 

عنوان 36

 

3-2-3 ضدعفونی نمونه‌های گیاهی………………………………………………………………………………….. 36

 

3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه…………………………………………………………………………………………. 37

 

3-2-4 تهیه ریزنمونه………………………………………………………………………………………………………. 37

 

3-2-5 بهینه سازی محیط کشت………………………………………………………………………………………. 37

 

3-2-6 بررسی نمونه‌های کشت شده………………………………………………………………………………… 38

 

3-2-7 تیمارهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………. 38

 

3-2-7-1 روش تهیه استوک EMS ………………………………………………………………………………… 39

 

3-2-7-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی………………………………………………. 39

 

3-2-7-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه…………………………………………………………….. 39

 

3-2-7-4 روش شستشوی تیمارها…………………………………………………………………………………… 40

 

3-3 استخراج مواد موثره گیاهی……………………………………………………………………………………….. 40

 

3-3-1 روش‌های استخراج اسانس……………………………………………………………………………………. 40

 

3-4 آنالیز اجزاء اسانس…………………………………………………………………………………………………… 41

 

3-5 آنالیزهای آماری……………………………………………………………………………………………………….  

 

         فصل چهارم: نتایج و بحث 42

 

4-1 بررسی نمونه‌های کشت بافتی……………………………………………………………………………………. 45

 

4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه……………………………………………………….. 46

 

4-2-1 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه………………………………………………………………… 47

 

4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه……………………………………………………………….. 47

 

4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ……………………………………………………………….. 48

 

4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی…………………………………………………….. 49

 

4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه……………………………………………………………… 50

 

4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ……………………………………………………… 51

 

4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه………………………………………………………………. 51

 

4-3 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی…………………………………………….. 52

 

4-4 استخراج اسانس………………………………………………………………………………………………………. 52

 

4-4-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس……………………………………………. صفحه

 

عنوان 53

 

4-4-2 نتایج آزمایشگاهی………………………………………………………………………………………………… 53

 

4-4-3 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه………………………………………………………….. 54

 

4-4-4 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس………………………………………………………………………………..  

 

         فصل پنجم: نتیجه‌گیری 55

 

5-1 بحث……………………………………………………………………………………………………………………… 55

 

5-1-1 کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………….. 56

 

5-1-2 اثرات موتاژن EMS …………………………………………………………………………………………… 60

 

5-2 نتیجه‌گیری……………………………………………………………………………………………………………… 61

 

5-3 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………. 62

 

فهرست منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………….. 64

 

فهرست منابع انگلیسی…………………………………………………………………………………………………….. 71

 

پیوست‌ها……………………………………………………………………………………………………………………….. 75

 

چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………….

چکیده

نعناع فلفلی با نام علمی Mentha piperitaیکی از انواع گیاهان دارویی می‌باشد که به دلیل تولید اسانس‌های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده‌های فراوانی دارد. استفاده از مواد موتاسیون‌زا از قبیل EMS می‌تواند تغییرات جهش‌زای نقطه‌ای در گیاه ایجاد کند که در نهایت منجر به ظهور فنوتیپ جدید در این گیاه با ارزش شوید. لذا این پژوهش با انجام تیمارهای متعدد از غلظت‌های مختلف EMS روی سرشاخه‌های رشد یافته در محیط کشت MS بدون هورمون و با غلظت‌های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% از EMS و مدت زمان‌های مختلف (24 و48 ساعت) و همچنین در قسمت مزرعه‌ای نیز از همین غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شد. ارزیابی‌ در داخل لوله آزمایش و مزرعه بطور همزمان انجام گرفت. پس از انتفال و رشد و نمو نمونه‌ها در شرایط in vitro، تیمارها با ماده جهش‌زا اتیل متان سولفانات مورد بررسی قرار گرفتند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیکی از قبیل طول ساقه و تعداد ریشه رونده جانبی در سطح 1% و تعداد برگ و تعداد جوانه در ساقه در سطح 5% پاسخ معنی‌داری را نشان دادند. نتایج این پژوهش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر فنوتیپی این گیاه دارویی دارد. غلظت 01/0% EMS بهترین نتیجه معنی‌دار را در سطح 1% و از کشت ریزنمونه‌های که شامل جوانه‌های جانبی و انتهایی بوده‌اند به‌دست آورده که برروی خصوصیاتی همچون طول ساقه، تعداد برگ و تعداد جوانه جانبی اثر داشت. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی‌اثر بودن این ماده اتیل متان سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.

کلمات کلیدی: اتیل متیل سولفانات (EMS)، اجزاء اسانس، کشت درون شیشه‌ای، محیط کشت MS، نعناع فلفلی (Mentha piperita).

1-1 مقدمه:

گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده‌اند و می‌توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می‌برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).

در بحث گیاهان دارویی، محدودیت‌های کاشت و نگهداری آن‌ ها متعدد می‌باشد که از آن جمله می‌توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه‌های گیاهی، کمبود زمین‌های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).

یکی از راه‌های رفع این محدودیت‌ها کشت بافت گیاهی[1] است. تکنیک‌های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.

استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان‌های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی در این زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند. در سبز فایل، دانشمندان علوم گیاهی با بهره گرفتن از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با بهره گرفتن از بیوتکنولوژی[2] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته[3] و پلی پلوئید[4] را نام برد.

گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می‌رویند که بسیاری از آن‌ ها از جمله نعناع فلفلی دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می‌باشند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با بهره گرفتن از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می‌رسد. کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه‌ای[5] و یا کشت استریل نیز مطرح می‌شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب‌بیگی و همکاران، 1385؛ سونانداکوماری و همکاران[6]، 2003). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می‌باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال 1756 توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس[7] در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم‌های گیاهی بود (غضنفری[8]، 1994).

اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمایش‌های وی روی کشت تک سلول‌ها پیشنهاد گردید (هابرلنت[9]، 1902). توسعه روش‌های کشت بافت و زیست‌شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می‌دهد که ژن‌های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می‌تواند کمکی جهت بررسی و واکنش‌های گیاه نعناع فلفلی نسبت به تکنیک‌های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش‌زائی همچون اتیل متان سولفانات[10] (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت‌های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.

1-1-1 اهمیت موضوع

برای انجام کشت بافت نعناع فلفلی (Mentha piperita) از بخش‌های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران[11]، 2011). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن‌ ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش‌های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش‌های نوین از جمله کشت درون شیشه‌ای (in vitro) ضرورت می‌یابد به همین منظور اولین بار در سال 1976 توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول‌های گیاهی حاوی متابولیت‌های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت‌های دارویی در شرایط درون شیشه‌ای اغلب، گیاهانی انتخاب می‌شوند که بازده تولید متابولیت‌های با ارزش در آن‌ ها بالا باشد (باقری و صفاری، 1387).

نعناع فلفلی به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می‌شود (امیدبیگی، 1384،1389). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره نعناع فلفلی صورت گرفته است (کاظم الوندی و شریفان، 1388). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. با توجه به اینکه تکثیر این گیاه از طریق بذر مشکل است (بدلیل بذور کم و نابارور)، بهترین و سریع‌ترین راه برای داشتن گیاه جهت مصارف صنعتی، کشت بافت است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت و بهینه‌سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف برای این گیاه ضرورت دارد.

1-1-2 فرضیات

1- کشت بافت یکی از راه‌های سریع در ازدیاد انبوه نعناع فلفلی می‌باشد.

2- نعناع فلفلی در محیط کشت همواره در دسترس برای اعمال هر گونه اعمال تیمار از قبیل جهش می‌باشد.

3- ایجاد جهش نقطه­ای تا چه میزانی می‌تواند بر روی مواد موثره و میزان اسانس تغییر ایجاد نماید.

1-1-3 اهداف پژوهش

1- آشنایی با تکنیک کشت بافت گیاه دارویی نعناع فلفلی و تکثیر آن در داخل شیشه.

2- بدست آوردن مقدار قابل توجه گیاه در حال رشد برای اعمال جهش نقطه‌ای در نعناع فلفلی.