فصل اول: کلیات تحقیق.. 2

1-1 گیاه­شناسی پپرومیا 2

1-2 نگهداری گیاه پپرومیا 2

1-3 نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان. 3

1-4 ترکیبات محیط­های کشت.. 5

1– 4 – 1 مواد غیر آلی.. 6

1– 4– 2 منبع کربن.. 6

1 – 4 – 3 ویتامین­ها 6

1 – 4 – 4 آمینواسیدها و مکمل­های آلی.. 7

1 – 4- 5 تنظیم کننده­ های رشد گیاهی.. 7

1 – 4 – 6   عامل ژله­ای­کننده 7

1– 4 – 6 – 1 آگار. 7

1-5 ظروف کشت.. 8

1 – 6 انتخاب و تهیه ریزنمونه. 8

1 – 7 ریزازدیادی.. 8

1-8 کودهای زیستی.. 9

1-9 باکتری­ های محرک رشد گیاه (PGPRها) 9

1-10 مکانیسم عمل PGPR ها 11

1-10-1 نقش مستقیم PGPRها 12

1-10-2 نقش غیرمستقیم PGPRها 13

1-11 اهداف تحقیق. 13

فصل دوم: ی بر تحقیقات انجام شده. 15

2– 1 سوابق استفاده از PGPR در کشت بافت سایر گیاهان. 15

2– 2 سوابق استفاده از PGPR در کشاورزی.. 15

فصل سوم: مواد و روشها 22

3 – 1 محل انجام آزمایش… 22

3 – 2 تهیه گیاه مادری.. 22

3-3 تهیه و واکشت سویه­های باکتریایی.. 22

3-4 ترکیبات و ساخت محیط کشت.. 23

3-5 ضدعفونی ریزنمونه­های گیاهی پپرومیا 24

3-6 شرایط کشت ریزنمونه­ها 26

3-7 کشت اولیه. 26

3-8 آزمایش بررسی اثر استفاده از تیمارهای مختلف گندزدایی در جلوگیری از آلودگی در کشت بافت گیاه پپرومیا 26

3-9 بررسی تاثیر افزایش غلظت فسفر بر اندام­زایی پپرومیا 27

3-10 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندام­زایی پپرومیا 28

3-11 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه. 28

3- 12 تاثیر تلقیح با باکتری بر سازگاری گیاهان تکامل یافته در گلدان. 29

3-13 صفات اندازه ­گیری شده 30

3-13-1 میانگین تعداد برگ در هر بوته. 30

3-13- 2 ارتفاع ساقه. 30

3-13-3 تعداد ریشه در هر بوته. 30

3-13-4 طول کل ریشه. 30

3-13-5 تعداد جوانه جانبی.. 30

3-13-6 توسعه برگی.. 30

3-13-7 وزن تر بوته. 31

3-13-8 وزن خشک بوته. 31

3-14 تجزیه آماری.. 31

فصل چهارم: نتایج و بحث.. 32

4-1 مقدمه. 32

4-2 بررسی اثر استفاده از تیمارهای مختلف گندزدایی در جلوگیری از آلودگی در کشت بافت گیاه پپرومیا 32

4– 3 بررسی تاثیر افزایش غلظت فسفر بر اندام­زایی پپرومیا 33

4-4 اثر سطوح مختلف ساکارز بر اندام­زایی پپرومیا 34

4-5 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه (2 هفته بعد از كشت) 34

 

 

4-5-1 تعداد برگ.. 35

4-5-2 طول ساقه باززا شده 36

4-5-3 تعداد ریشه باززا شده 37

4-5-4 کل طول ریشه باززا شده 37

4-5-5 میانگین طول ریشه. 38

4-5-6 تعداد جوانه رشد كرده 39

4-5-7 توسعه برگی.. 39

4-6 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد ریزنمونه جوانه جانبی درون شیشه (چهار هفته بعد از كشت)  41

4-6-1 تعداد برگ.. 41

4-6-2 طول ساقه. 42

4-6-3 تعداد ریشه. 43

4-6-4 کل طول ریشه باززا شده 44

4-6-5 میانگین طول ریشه. 46

4-6-6 تعداد جوانه رشد كرده 47

4-6-7 توسعه برگی.. 47

4-7 تاثیر سطوح هورمونی و تلقیح با باکتری بر رشد گیاهچه­های کشت بافتی پپرومیا در مرحله سازگاری.. 47

4-7-1 تعداد برگ.. 48

4-7-2 طول ساقه. 49

4-7-3 تعداد ریشه. 49

4-7-4 کل طول ریشه. 49

4-7-5 میانگین طول ریشه. 50

4-7-6 توسعه برگی.. 50

4-7-7 وزن تر بوته. 51

4-7-8 وزن خشک بوته. 52

4-8 اندام­زایی مستقیم در گیاه پپرومیا 53

فصل پنجم: نتیجه گیری.. 54

5-1 بحث.. 54

5-2 نتایج.. 56

5-3 پیشنهادات.. 57

منابع.. 58

چکیده:

باکتری­ های محرک رشد گیاهی به عنوان یکی از راه­های افزایش رشد گیاه شناخته می­شوند. امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزم­ها انواع مواد (از جمله اكسین، سیتوكینین، جیبرلین و سیدروفورها) را به محیط اضافه می­ کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. هدف از این تحقیق بررسی اثرات دو باکتری محرک رشد گیاهی بر روی تکثیر گیاه پپرومیا از طریق کشت بافت بود. آزمایش به صورت طرح فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا شد. فاکتور باکتری محرک رشد شامل سطوح: 0: شاهد (بدون باکتری)، 2: Azospirillum lipoferrum، 3:Pseudomonas fluorescent و فاکتور هورمون شامل: 0: بدون هورمون، 1: سطح هورمون برابر با 5/1 میلی­گرم در لیتر IAA و 1 میلی­گرم در لیتر 2IP و 2: مقدار هورمون دو برابر غلظت قبلی بودند. قبل از کشت مقدار 08/0 میلی لیتر از کشت مایع باكتری­ها، بر روی محیط کشت تلقیح شد و سپس جوانه­های پپرومیا در محیط­های مذکور کشت شدند. بعد از گذشت 4 هفته از کشت، جوانه­های کشت شده گیاه پپرومیا به اندازه کافی رشد کرده و قابل انتقال به خاک شدند. قبل از انتقال گیاهچه­های جوان به گلدان و بعد از طی کردن مراحل سازگاری اندازه ­گیری صفات مورد نظر انجام شد. نتایج نشان داد در آزمایش درون شیشه ­ای اثر متقابل هورمون و باکتری بر کل طول ریشه و میانگین طول ریشه معنی­دار بود. تیمارAzospirillum بدون هورمون دارای بیشترین طول ریشه بود و اختلاف معنی دار با دیگر تیمارها داشت. اثر اصلی باکتری بر طول ساقه و تعداد برگ معنی­دار بود. مشاهده شد تلقیح ریزنمونه­ها با هر دو باکتری نسبت به شاهد باعث افزایش معنی­دار طول متوسط شاخه­های باززا شده گردید. افزایش طول ساقه در تیمارهای باکتری نسبت به شاهد در حدود 5/1 برابر بود. در مرحله سازگاری، اثرمتقابل هورمون و باکتری بر تعداد برگ، توسعه برگی و وزن خشک و اثر باکتری بر وزن تر و اثر هورمون بر کل طول ریشه و وزن خشک معنی­دار بود. در کل تلقیح با باکتری تاثیرات مثبتی بر تعداد برگ، توسعه برگی، طول شاخه و طول ریشه داشت. ولی تاثیر منفی تلقیح باکتری بر وزن تر و خشک مشاهده گردید. افزایش سطح هورمون تاثیر مثبت بر طول کل طول ریشه داشت.

کلمات کلیدی: کشت بافت،lipoferrum Azospirillum، Pseudomonas fluorescent، فیتوهورمون، پپرومیا.

 1-1 گیاه­شناسی پپرومیا  

گیاه پپرومیا (برگ قاشقی) از جنسPeperomia و خانواده Piperaceae می­باشد. این جنس دارای بیش از ۱۰۰۰ گونه مختلف از گیاهان همیشه­سبز بالارونده است که اغلب آنها برگ­های زیبایی دارند. گونه مذکور بومی نواحی استوایی آمریکا بوده و گیاهی است بسیار کم رشد که ارتفاع آن به حدود ۸ تا ۲۵ سانتی­متر می­رسد. برگ­های آن بسیار زیاد و قلبی شکل می­باشند که از قسمت مرکزی گیاه خارج می­شوند. برگ­های پپرومیا صورتی کمرنگ می­باشد. گل­ها به رنگ سفید و به شکل گل آذین سنبله مانند و به طول ۱۲ تا ۱۵ سانتی­متر هستند و از اوایل بهار تا اواخر پاییز به چشم می­خورند. این گیاه به نور متوسط، حرارت زیاد، خاک همیشه مرطوب، رطوبت ۵۰ تا ۹۰ درصد و خاک قلیایی احتیاج دارد. کود مورد نیاز این گیاه را می‌توان به میزان ۲ گرم در لیتر، هر دو هفته یکبار از فروردین تا مهرماه، مورد استفاده قرار داد (کریمی، 1390).

1-2 نگهداری گیاه پپرومیا  

پپرومیا گیاهی است گرمسیری با برگ­های چرمی شکل و قاشقی (شکل1-1)، این گیاه دارای نیاز آبی کم (بسته به شرایط محیط) می­باشد، و همچنین نیاز نوری کمی دارد و سایه آپارتمان را به خوبی تحمل می­ کند، هم بصورت مجزا و هم در کاشت گروهی زیباست. این گیاه اگرچه رشد سریعی ندارد، ولی در هر شرایطی در آپارتمان پرورش می­یابد. معمولا آن­ها را در تراریوم و باغ شیشه ­ای یا مجموعه­ی گل­های یک سبد پرورش می­دهند. با توجه به شکل ظاهری و نحوه­ رشد آنها را به سه گروه تقسیم نموده ­اند: گروه اول: بوته­ای که دارای دمبرگ­های قرمز هستند، بعضی نیز برگ­های گوشتی و قلبی شکل دارند، گروه دوم: دارای ساقه­های بلند و قرمز رنگ هستند و بعضی ساقه­های گوشتی دارند و لبه برگ­ها ارغوانی است و گاه سطح برگ با موهای بسیار ظریفی پوشیده شده است. گروه سوم: گروه بالارونده که به داربست یا قیم بسته می­شوند و بالا می­روند، با اینکه از گلدان آویزان می­شوند و دارای ساقه­های قرمز و بسیار ظریف نقره­ای و بعضی دارای برگ­های سبز آبدار هستند و بخصوص برای گلدان­های آویز بسیار مناسبند. گیاه پپرومیا یک ساقه گل­دهنده با شاتون­های سبز رنگ تولید می­ کند که ارزش زینتی ندارد، زمانی که این گیاه به گل می­رود، کیفیت برگ­ها و زیبایی آن کمتر می­ شود، با حذف ساقه­های گل­دهنده می­توان گیاه را مرتب به حالت رویشی و نونهالی مشاهده کرد. این گیاه به سرمای زیاد مقاومت ندارد و حداکثر می ­تواند در زمستان 15 درجه سانتی ­گراد را تحمل نماید و در فصل رشد دمای 24 تا 30 درجه برای آن بسیار مناسب است. این گیاه در زیر تابش اشعه فلورسنت پژمرده می­ شود و نیاز چندانی به آب ندارد و همیشه مقدار زیادی آب در برگ­های آن وجود دارد و سطح خاک گلدان بین دو آبیاری باید کاملا خشک شود، ولی نباید آبیاری آنقدر به تعویق افتد که برگ­ها پژمرده شوند. در زمستان به آب ولرم نیاز دارد و مقدار آبیاری باید بسیار کمتر باشد، ریشه آن سطحی است و گسترش چندانی ندارد و در هوای آلوده، زرد و خشک می­ شود، در صورت آب دادن زیاد اطراف یقه ساقه، موجب پوسیدگی اطراف آن می­ شود. میزان رطوبت هوای لازم برای این گیاه حدود 50 درصد است، چنانچه رطوبت و حرارت و سرما از حد خود تجاوز کند، لکه­هایی بر سطح برگ ظاهر می­شوند، برگ را بی­حس می­ کنند و می­افتد. هر دوماه یکبار سطح خاک گلدان را باید خراش داد تا هوا به داخل آن نفوذ کند و در فصل بهار گلدان را در فضای آزاد در محلی سایه قرار دهید تا حالت طبیعی خود را به دست آورد. هر اندازه قابلیت نفوذ خاک این گیاه بیشتر باشد ریشه و ساقه از پوسیدگی محفوظ خواهد بود. بهتر است برای تهیه خاک گلدان این گیاه یک قسمت پیت بعلاوه یک قسمت ماسه به همراه یک قسمت خاک باغچه استفاده شود و کف گلدان مقداری ماسه و سنگریزه بریزید، زمان مناسب برای تغییر گلدان این گیاه فصل بهار است. پپرومیای ابلق یا سفید با قلمه­های بذر و ساقه تکثیر می­ شود و پپرومیای سبز با قلمه­های برگ و ساقه تکثیر می­ شود. بهتر است در بهار و تابستان از قلمه­های یک ساله برای گیاه استفاده نمود و برای این کار قلمه را به میزان 4 تا 5 سانتی­متر در ماسه شسته فرو برده و در محلی که دمای آن 18 درجه باشد در تاریکی قرار می­دهند. در مورد انواع گوشتی آن برگ را روی سطح ماسه خوابانیده و روی آن ماسه شسته می­ریزند، پس از مدتی در انتهای رگبرگ­ها ریشه ظاهر می­ شود (کریمی، 1390).

1-3 نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان

تكنیک كشت بافت گیاهی نقش كلیدی در انقلاب سبز دوم دارد كه در این انقلاب تغییرات ژنی و بیوتكنولوژی جهت پیشرفت كیفیت و كمیت محصولات زراعی بكار می­روند. این تكنولوژی برای محدوده وسیعی از گیاهان زراعی و گونه­ های درختی جهت حل مشكلات بكار گرفته شده است. این روش بواسطه تلاش­ های مداوم و پیگیر تعداد زیادی از دانشمندان كه كارهای پایه­ای انجام داده­­­اند، ممكن شده است. كشت بافت گیاهی اصطلاحی است كه بطور كلی برای رشد درون شیشه ­ای و عاری از بیماری گیاه بر روی محیط مغذی بكار می­رود. این تكنولوژی بر سه اصل اساسی استوار است (باقری و همکاران، 1381):

• قسمتی كه باید از گیاه اصلی جدا شود.
• ریزنمونه باید در شرایط شیمیایی (محیط كشت) و فیزیكی (محیطی) تعریف شده نگهداری شود.
• شرایط استریل و عاری از آلودگی باید حفظ شود

شکل 1-1 گیاه پپرومیا (برگ قاشقی)

دانش امروزی اجازه بكارگیری هر قسمت از گیاه را برای شروع كشت می­دهد. قسمتی از گیاه كه برای این منظور بكار می­رود ریزنمونه نامیده می­ شود. انتخاب هر قسمت از گیاه با توجه به هدف از كشت متفاوت است. مواد و نمونه­هایی كه از محیط خارج جمع­آوری و به آزمایشگاه آورده می­شوند، در حین انتقال، بهتر است در شرایط مناسب نگهداری شوند تا فعالیت­های كاتابولیكی به حداقل برسد. مواد بطور كامل باید با آب جاری و مایع شوینده شستشو داده شوند (مانند تویین-80[1])، بعد از شستشو و حذف ذرات چسبنده بسته به نوع ریزنمونه مراحل استریل انجام شده و سپس كشت انجام می­ شود. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشه ­ای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه می­ شود، این روش به عنوان یکی از شاخه­های زیست­فناوری، کاربرد گسترده­ای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت می­ شود. در این نوع کشت، شرایط به گونه­ ای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشه ­ای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلول­ها و بافت­ها می­باشد (شریفی و همکاران، 1389).

در سال 1838 شوان و شیلدن[2] نظریۀ توتی­پوتنسی[3] را ارائه نمودند. براساس این نظریه، هر سلول گیاهی، هنگامی که در محیط غذایی مصنوعی و شرایط مناسب کشت شود، می ­تواند به گیاهی جدید و کامل تبدیل شود. بعد­ها دانشمند آلمانی، هابرلند[4] (1902) برای اولین بار به بررسی این نظریه پرداخت و ادعا کرد که اگر محیط و تغذیه سلول­های کشت شده مناسب باشند، سلول­های کشت شده می­توانند، گیاهان نرمالی را بوجود آورند. اما تلاش­ های او در انجام کشت بافت ناموفق بود. او همچنین معتقد بود که قطعه قطعه کردن نامحدود بافت­های گیاهی بر روی قدرت تکثیر سلول­ها تأثیر نمی­گذارد. او استفاده از مایع موجود در کیسه جنینی و تولید جنین­های مصنوعی را از سلول­های رویشی پیشنهاد کرد (احمدیان، 1380). به دلیل تاخیر در کشف هورمون­های گیاهی، کشت بافت گیاهی پس از کشت بافت حیوانی و انسانی شروع شد. اولین کشت موفقیت­آمیز بافت­های گیاهی، توسط وایت[5] در سال 1934 انجام شد. او در سال 1939 اولین کشت موفقیت­آمیز کالوس هویج و توتون را گزارش کرد. اولین هورمون تنظیم­کننده رشد که کشف شد، اکسین بود که موفقیت بزرگی را برای کشت بافت در شرایط درون شیشه ­ای به همراه داشت. بعد از کشف تنظیم­کننده رشد کینتین در سال 1955، انگیزه بیشتری برای کشت بافت حاصل شد. بزرگ­ترین مشوق برای استفاده از فنون کشت بافت گیاهی برای تکثیر بسیاری از گونه­ ها، ممکن است کار اولیه مورل[6] روی تکثیر ارکیده و کار موراشیگ و اسکوگ[7] در 1964 در ایجاد محیط کشت جدیدی با غلظت بالای نمک­های معدنی بوده باشد (احمدیان، 1380).

1-4 ترکیبات محیط­های کشت  

محیط کشت یکی از مهم­ترین اجزاء کشت یاخته و بافت گیاهی است. کاربرد موفق فنون کشت بافت گیاهی به میزان زیادی به محیط کشتی با ترکیب صحیح بستگی دارد. ترکیب محیط­های کشت به روش خاص کشت به کار رفته تغییر می­یابد. برای نمونه روش­هایی مانند باززایی گیاهان کامل از یاخته­ها یا بافت­ها نیازمند محیط­های کشتی با ترکیبات مختلف برای آغازش هریک از مراحل توالی تکوینی است. علاوه بر ترکیب آن، نقش مهم دیگر محیط کشت فراهم کردن محیط فیزیکی مناسب برای یاخته­ها و بافت­ها برای رشد می­باشد. برای نمونه محیط­های کشت جامد، نقشی شبیه خاک را از طریق فراهم کردن یک زمینه و حامل فیزیکی که ریزنمونه­های بافت بتوانند تماس با هوا را برای تبادل گاز حفظ نمایند یا جایی که گیاهچه­های باززایی شده بتوانند ریشه دهند، ایفا می­ کنند. از سوی دیگر، کشت­های تعلیقی در حال رشد در کشت مایع در حال تکان خوردن، یاخته­ها را قادر می­سازد تا حداکثر تماس را با اجزای محیط کشت حفظ کنند و تبادل گاز­ها تسهیل شود. تمام یاخته­های گیاهی زنده برای حفظ و رشد و نمو نیازمند آب، عناصر غذایی (عناصر معدنی و ترکیبات آلی) و تنظیم­کننده­ های رشد گیاهی (هورمون­ها) هستند. ترکیبات محیط­های کشت بافت گیاهی معمولا این نیازمندی­ها را منعکس می­سازند و چندین ترکیب اختصاصی (مانند محیط کشت موراشیک و اسکوگ یا محیط ام. اس) که به طور رایج برای کشت به کار می­روند دارای ترکیبات پایه مشابهی هستند. مواد مورد نیاز برای کشت یاخته گیاهی را می­توان به سه گروه تقسیم کرد که عبارتند از: عناصر غذایی معدنی، عناصر غذایی آلی و تنظیم­کننده­ های رشد گیاهی (باقری و همکاران، 1383؛ شریفی و همکاران، 1