فصل اول. 2

کلیات تحقیق.. 2

1-1. اهداف اصلاحی در بنفشه آفریقایی.. 5

1-2. تنوع ژنتیكی و ضرورت شناخت آن. 6

1-3. روش­های برآورد تنوع ژنتیكی.. 7

1-3-1. برآورد تنوع ژنتیكی با بهره گرفتن از نشانگرهای دی ان ای.. 8

فصل دوم. 9

ادبیات و پیشینه تحقیق. 9

2-1. گیاه­شناسی بنفشه آفریقایی.. 9

2-1-1. میوه در Saintpaulia. 10

2-2. خاستگاه و پراکنش بنفشه آفریقایی.. 11

2-3. گونه­ های مهم بنفشه آفریقایی.. 11

2-3-1. برخی گونه­ های فهرست شده به دنبال طبقه بندی Burtt 12

2-4. کشت و تکثیر. …13

2-4-1. شرایط کشت بنفشه آفریقایی.. 13

2-5. بیماری­های مربوط به بنفشه آفریقایی.. 17

2-5-1. بیماری­های ناشی از عوامل غیر زیستی.. 17

2-5-2. بیماری­های ناشی از عوامل زیستی.. 18

2-6. اهمیت بنفشه آفریقایی.. 20

2-7. اصلاح بنفشه آفریقایی.. 21

2-7-1. روش­های اصلاحی.. 21

2-8. اهمیت تنوع ژنتیكی.. 21

2-9. حفاظت منابع ژنتیكی.. 22

2-10. روش‌های ارزیابی تنوع ژنتیكی.. 23

2-10-1. نشانگرهای مورفولوژیكی.. 23

2-10-3. نشانگرهای مولكولی.. 24

2-10-4. نشانگرهای پروتئینی.. 24

2-10-5. نشانگرهای DNA.. 24

2-10-6. نشانگرهای غیرمبتنی بر پی سی آر. 26

2-10-7- نشانگرهای مبتنی بر پی سی آر. 27

2-10-8. DNA پلی مورف تکثیر یافته تصادفی.. 31

2-10-8-1. کاربرد به کارگیری تکنیک RAPD ..32

2-10-8-2. کاربردهای نشانگر RAPD …..32

2-10-8-3. مزایای نشانگرهای RAPD …………..32

2-10-8-4. معایب نشانگرهای RAPD ……….34

2-10-8-5. ویژگی­ها و کاربردهای نشانگرهای مرتبط با RAPD ……….35

2-11. واکنش زنجیره پلی­مراز. 37

2-11-1. اجزای واكنش زنجیره‌ای پلیمراز(PCR) 38

2-11-2. مراحل تكثیر. 40

2-11-3. كاربردهای پی سی آر. 41

2-12. الكتروفورز. 42

2-12-1. الكتروفورز ژل آگارز. 43

2-13. درخت فیلوژنتیک… 45

2-13-1. پیچیدگی ژنوم و بررسی فیلوژنتیک: 45

2-13-2. اندازه‌گیری فواصل و تشابهات ژنتیكی.. 49

2-13-3. روش‌های آماری برای تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیكی.. 50

2-13-4. تجزیه خوشه‌ای.. 50

2-13-5. ضریب همبستگی كوفنتیكی.. 51

2-13-6. تجزیه به مؤلفه­ های اصلی.. 51

2-14. ی بر تحقیقات پیشین.. 52

فصل سوم……..57

روش شناسی تحقیق.. 57

3-1. تهیه نمونه گیاهی.. 57

 

 

3-2. استخراج DNA.. 57

3-3. تعیین كیفیت نمونه­های DNA.. 59

3-4. تعیین كمیت نمونه‌های DNA.. 60

3-5. تنظیم غلظت نمونه‌های DNA 60

3-6. انتخاب آغازگرها 60

3-7. انجام واكنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز. 60

3-8. الكتروفورز فراورده‌های PCR.. 62

3-9. تجزیه و تحلیل‌های آماری.. 62

فصل چهارم. 64

تجزیه و تحلیل داده ­ها 64

4-1. تعیین كمیت و كیفیت DNA ژنومی.. 64

4-2. واكنش زنجیره‌ی پلیمراز. 65

4-3. تجزیه باندهای ایجاد شده 66

4-3-1. بررسی محتوای اطلاعاتی به دست آمده 67

4-4. تجزیه خوشه‌ای.. 72

فصل پنجم. 74

بحث و نتیجه ­گیری.. 74

5-1. استخراج DNA.. 74

5-2. واکنش زنجیره پلی­مراز…….75

5-2-1. بهینه سازی مواد به کار رفته در پی سی آر………..75

5-2-2. بهینه سازی شرایط پی سی آر……………75

5-3. پیشنهادات.. 76

منابع. 78

پیوست… 82

چکیده انگلیسی. 84

بررسی تنوع ژنتیکی بنفشه آفریقایی(Saintpauli ionantha) با بهره گرفتن از مارکر مولکولی RAPD

 چکیده

تنوع ژنتیكی و ارزیابی ارقام مطرح بنفشه­ی آفریقایی(Saintpauli ionantha) در سطح مولكولی با بهره گرفتن از نشانگر RAPD انجام شد. به منظور استخراج DNAاز روش تغییر یافته Doyle and Doyle استفاده شد و در گام بعد 6 ژنوتیپ با 15 آغازگر مورد بررسی قرار گرفتند. از 15 آغازگر مورد بررسی روی DNA ژنومی 311 باند تولید شد که 290 باند پلی مورفیسم داشتند. آغازگر I، کمترین باند و آغازگر G بیشترین باند را تولید کرد. اندازه­ قطعات DNA تولید شده بین 200 بیس باز تا 4000 بیس باز بود. میانگین قدرت تفكیک نیز 79/0 بود. باندهای تولید شده برای آنالیزهای استاتیک مورد استفاده قرار گرفتند. برای رسم درخت فیلوژنیک از نرم افزار UPGMA استفاده شد. تشابه ژنتیکی بین 57/0 تا 72/0 است. و ضریب جاکارد بین دندروگرام و ماتریس تشابه 78/0 به دست آمد که نشان دهنده برازش مناسب دندروگرام به ماتریس تشابه بوده است. نتایج به دست آمده نشان می­دهد که نشانگر مولکولی RAPD ابزاری سودمند برای بررسی پراکندگی ژنتیکی و ارتباطات خانوادگی بین واریته­های بنفشه­ی آفریقایی است.

کلمات کلیدی: بنفشه­ی آفریقایی، مارکر مولکولی، تنوع ژنتیکی، آنالیزهای استاتیک، درخت فیلوژنی

کلیات تحقیق

جمعیت جهان در قرن 21 از مرز 6 میلیارد نفر كنونی گذشته و به بیش از 10 میلیارد نفر خواهد رسید. یكی از معایب این افزایش جمعیت استفاده بی­رویه از منابع طبیعی در جهت افزایش تولیدات كشاورزی می‌باشد. در بسیاری از این موارد، این افزایش تولید با تخریب منابع زیستی و فرسایش شدید ذخایر توارثی همراه بوده است. حفاظت و استفاده از منابع ژنتیكی گیاهی برای بقاء و بهبود تولیدات زراعی ضروری می‌باشد و به عنوان نیاز اساسی در توسعه پایدار، خلق واریته­های جدید، و كاهش فقر محسوب می‌شود.

تنوع، مبنای همه گزینش­ها است و انتخاب ژنوتیپی نیز نیازمند تنوع است. با بالا رفتن تنوع ژنتیكی در یک جامعه، حدود انتخاب هم در طبیعت و هم به­ طور مصنوعی وسیع می‌شود. با توجه به رابطه مثبت بین میزان تنوع ژنتیكی و مقدار وقوع تغییرات تكاملی در آن، رابطه مشابه­ی نیز بین كارایی بهبود ژنتیكی اصلاح یک جامعه و تنوع ژنتیكی برای صفت مورد علاقه موجود است. تمایل به حذف تنوع ژنتیكی در توده­های بومی اولیه، واریته­های سازگار به نیازهای غیر قابل پیش بینی آینده را به خطر می­اندازد.

بنابراین حفظ و نگهداری ذخایر توارثی ضروری می‌باشد. به­ طور كلی یكی از اولین قدم­ها در یک برنامه به نژادی موفق، تشخیص صحیح ژنوتیپ‌های مطلوب است، كه برای صحیح عمل نمودن دراین راستا به نكات خاصی باید توجه نمود. اثرات متقابل ژنوتیپ و محیط، اتخاذ روش صحیح گزینش، و استفاده از نشانگرهای مولكولی مناسب برای تشخیص ژنوتیپ­ها تو صیه می‌گردد (صالحی، 1378).

برای بررسی تنوع ژنتیكی، نشانگرهای مختلفی وجود دارد که شامل نشانگرهای فیزیولوژیكی، بیوشیمیایی، و مولكولی می­باشد.از معایب نشانگرهای فیزیولوژیكی این است كه در بیشتر موارد تحت تأثیر محیط قرار دارند و گاهی برای مشاهده و ثبت آن­ها باید منتظر ظهور آن­ها ماند كه در مورد گیاهان چند ساله بسیار مشكل می کند. علاوه براین تعداد نشانگرهای مورفولوژیكی كم می‌باشد.

نشانگرهای پروتئینی نیز معایب مخصوص خود را دارا می‌باشند؛ با توجه به این­كه روش­های رنگ آمیزی پروتئین­ها در مورد آیزوزایم­ها چندان زیاد نیست، تعداد آیزوزایم­ها قابل ثبت و مشاهده كه می­توان از آن­ها به عنوان نشانگر استفاده نمود، به صد نمی‌رسد كه این محدودیت از عمده ترین معایب آن­ها است و موجب كاهش كارایی آن­ها می‌گردد. از نكات منفی دیگر این نشانگرها، محدودیت تنوع ژنتیكی قابل ثبت در آیزوزایم­ ها است. به عبارت دیگر آیزوزایم­ها نه تنها كم هستند، بلكه چند شكلی و تفاوت قابل ثبت نیز در آن­ها چندان زیاد نیست. لذا با توجه به معایب نشانگرهای مورفولوژیكی و پروتئینی بهتر است از نشانگرهای مولكولی استفاده كرد، زیرا در آن­ها دقت بالا بوده و كمتر تحت تأثیر شرایط محیطی و غیره قرار می­گیرند (قره­یاضی، 1377).

روش­های مختلف انگشت نگاری دی ان ای اغلب به دلایل ذیل با هم تفاوت دارند:

1- پیچیدگی روش­های مورد استفاده

2- مقادیر دی ان ای ژنومی

3- نیاز به اطلاع از توالی ژنومی

4- قدرت تحلیل و تعیین وابستگی ژنومی

5- مقدار هزینه

6- وسعت كاربرد

در این بین نشانگر رپید در بررسی تنوع ژنتیكی بین ارقام زراعی، طبقه بندی آن­ها و نیز تهیه نقشه‌های پیوستگی و آنالیز ژرم پلاسم كاربرد وسیعی پیدا كرده است (اهم و مکنزی، 1992)[3].

نشانگرهای رپید به وسیله تكثیر تصادفی قطعات دی ان ای ژنومی با آغازگرهای منفرد 10 نوكلئوتیدی همراه با توالی‌های اختیاری به­دست می‌آیند و مزایای فراوانی نسبت به سایر نشانگرها دارند از جمله می­توان به میزان هزینه و كار كمتر، نیاز كمتر به تكنولوژی پیشرفته، نامحدود بودن تعداد، امكان بررسی همزمان چندین لوكوس در ژنوم نمونه‌ها، تجزیه و تحلیل سریع و آسان تعداد زیادی از نمونه­ها، و عدم استفاده از مواد خطرناك رادیواكتیو اشاره كرد (كیانی و همكاران، 1381).

از كاربردهای رپید می‌توان به موارد ذیل اشاره کرد(كیانی و همكاران، 1381):

1) تعیین جنسیت

2) تولید آغازگرهای اختصاصی واکنش زنجیره پلی­مراز برای ژنوم­های ناشناخته

3) تجزیه و تحلیل كمی نمونه­های زیستی مختلف

4) بررسی روند تكامل و رده­بندی موجودات

5) تجزیه تحلیل ژرم­پلاسم‌ها

6) تعیین قرابت و یا فاصله ژنتیكی گونه‌ها

با وجود صنعتی شدن کشورها و استرس­های ایجاد شده، داشتن محیطی آرام و زیبا یکی از ضروریات بوده است که گل­ها می­توانند بخشی از این آرامش را به جامعه انسانی هدیه دهند.

بنفشه­ی آفریقایی به­عنوان عروس گل­های آپارتمانی در اروپا مطرح است که نقش به­سزایی در فراهم آوردن محیطی آرام و زیبا بازی می­ کند. بنفشه­ی آفریقایی با نام علمی Saintpaulia ionantha(نام ionantha نیز در زبان یونانی به معنای شبیه بنفشه است) و با نام عمومی African violet، متعلق به خانواده­ی ژسناریاسه می­باشد و باید گفت که در حال حاضر حدود بیست گونه از آن شناخته شده است.

بنفشه آفریقایی در سال 1892 میلادی در آفریقای شرقی توسط بارون والتر فونت سنت پل کشف گردید. او به افتخار نام خانوادگی خود که برای اولین بار این گیاه را کشف نموده بود آن را سنت پولیا نام­ گذاری کرد. این گیاه در کشور آلمان به نام بنفشه اوزامبارا نیز معروف می­باشد .آب و هوای حاره­ای شرایط مناسبی برای رشد این گیاه می­باشد (ایستوود، 1998)[5]. این گیاه بومی نقاط گرمسیری آفریقایی جنوبی است و از لحاظ کرموزومی این گیاه دیپلوئید بوده و به­صورت 2n=30 است (میرانتو، 2005) .[6]

بنفشه­ی آفریقایی گیاهی نهاندانه بوده و بذرهای آن در تخمدان گل محفوظ می­ماند. این گیاه دولپه­ی بوده، جام گل به­ طور معمول دو لپه یعنی به دو دسته گلبرگ­های بالا و پایین تقسیم می­ شود. هر یک از گل­ها دارای دو تا چهار بساک مسئول تولید گرده بوده که به انتهای گل متصل است و نزدیک تخمدان قرار دارد. ساقه که گل­ها را بر روی خود نگه می­دارد از دو قسمت اصلی و فرعی تشکیل می­گردد.

رنگ بنفش گل این گیاه در یک دوره گلدهی ممکن است به­صورت تیره و یا روشن درآید و در دوره­ دیگر به دلیل نوسانات اسیدی یا قلیایی بودن خاک، اثر آبیاری و یا کوددهی تبدیل به ارغوانی شود. سبزی برگ بنفشه آفریقایی، گاهی به­صورت دو رنگ نمایان می­ شود که علت آن وجود رنگدانه­ های کلروفیل، کاروتن و آنتوسیانین است که در هر سلول برگ وجود دارد. دلیل ابلق بودن برگ در این گیاه نبود کلروفیل در قسمتی از برگ می­باشد. گیاهان با برگ­های ابلق به­ طور عموم گیاهان ضعیف­تری هستند و احتیاج به مراقبت و توجه بیشتری دارند. رعایت بعضی نکات پرورشی مانند هوای به نسبت خنک، نور کم و استفاده از کود بدون نیتروژن باعث بروز برگ­های ابلق می­گردد.

به طور کلی این گیاه به دو شکل رشد می­ کند:

1- رشد گیاه با برگ­های متقارن و مشابه گل رز که شکل رایج رشد است.

2- رشد گیاه که به صورت رونده که اغلب برای قرار دادن در گلدان­های آویز بسیار مناسب است (چارلز، 1998)[7].

اولین جشنواره­ی بنفشه­ی آفریقایی در 1946 میلادی در آتلانتای گرجستان برگزار شد. شهرت این گیاه در حدی است که پلیس آتلانتا برای کنترل ترافیک از آن استفاده کرد. انجمن بنفشه­ی آفریقایی چندی بعد در آمریکا برپا شد و امروزه در بسیاری از کشورهای مدرن می­توان آن­را مشاهده کرد (کامپر، 2002)[8].

1-1. اهداف اصلاحی در بنفشه آفریقایی

اهداف اصلاحی هر محصولی بسته به نیاز هر منطقه متفاوت می‌باشد. به­ طور خلاصه می‌توان اهداف اصلاحی هر محصول را به چهار گروه شامل عملكرد به تنهایی، كیفیت بذر، مقاومت به آفات و بیماری­ها و اصلاح خصوصیات زراعی تقسیم بندی نمود. برای انجام موفقیت آمیز اصلاح یک گیاه زراعی اولین كار یافتن تنوع ژنتیكی مطلوب می‌باشد (عزیزی وهمكارن، 1378).