واژه های كلیدی: تكثیر دایره ای چرخان[4]، كلادوفیالوفورا بانتیانا [5]، كلادوفیالوفورا ساموفیلا [6]، فئوهایفومایكوزیس[7].

 مقدمه

امروزه با افزایش کیفیت استانداردهای بهداشتی لزوم به پیشگیری و نهایتا درمان سریع بیماری ها اجتناب ناپذیر می باشد. لذا در این راستا یکی از ابزار های مهم در این مقوله تشخیص به موقع و دقیق می باشدکه یکی از عوامل اصلی کنترل کیفی در کلیه زمینه های بهداشتی و درمانی است. با پیشرفت های انجام شده در علم ژنتیک راه کارهایی در پیش روی محققین قرارگرفته است که توسط آن توانسته اند قدم های بسیار بلندی در امر تسریع کنترل کیفی و تشخیص بیماری ها بردارند. یکی از تحولات عظیم در بحث ژنتیک و به طبع آن تشخیص طبی، اختراع روش واکنش زنجیره ای پلیمراز می باشد.

این تکنیک علاوه بر کمک به اجرای پروژه تعیین توالی موجودات بخصوص انسان در بسیاری از علوم کاربرد پیدا کرده است از جمله ایجاد موجودات تراریخت، کمک به درمان بیماری های مختلف، تولید محصولات صنعتی و دارویی، و از همه مهمتر افزایش دقت و سرعت در بررسی و آزمایش های تشخیصی بوده است.

با این وجود به این تکنیک نیز اشکالاتی وارد بوده که از آن جمله می توان نیاز واکنش زنجیره ای پلیمراز به دستگاه گران قیمت ترمال سایکلر [8]و همچنین وقت گیر بودن و نیز احتمال آلودگی و ایجاد واکنش های ناخواسته اشاره کرد که هر کدام محدودیت هایی را در پیش پای متخصصین قرار داده است.

خوشبختانه با ایجاد پایگاه داده های ژنی (Gene Bank) و پروتئینی محققین به روش هایی دست یافته اند که به کمک علم نوپای بیوآنفورماتیک میتوان روش های بسیار دقیق تر، اختصاصی تر و سریع تر از تکنیک های متداول موجود در علوم تشخیصی ارائه نمود(8،9).

در این پروژه سعی شده علاوه بر بررسی تکنیک های جدید مولکولی که به تازگی توسط محققین جهت رفع یکی از نواقص ذکر شده برای واکنش های زنجیره ای پلیمراز به مطالعه آن ها پرداخته اند ، با انتخاب دو واریته از جنس کلادوفیالوفورا که هردو از لحاظ فنوتیپکی بسیار مشابه هم بوده و از نظر فیلوژنی و تاکسونومی به عنوان دو سویه خواهری طبقه بندی شده است به امکان سنجی عملی و بررسی کاربرد تکنیک تکثیر دایره ای چرخان به تشخیص دوگونه قارچی پرداخته شود.

یکی از این گونه ها، کلادوفیالوفورا بانتیانا می باشد که جزء قارچهای سیاه بیماری زا بوده و دیگری کلادوفیالوفورا ساموفیلا می باشد که در دهه اخیر كشف و از طبیعت جداسازی شده و بیماری زایی آن هنوز به اثبات نرسیده است.

در این روش پیش از پرداختن به واکنش باید با بهره گرفتن از پایگاه داده های ژنی توالی اختصاصی گونه مورد نظر را یافت و از اختصاصی بودن آن اطمینان حاصل نمود و در نهایت با طراحی یک پروب اختصاصی نسبت به بهینه سازی انجام واکنش اقدام کرد.

برای بررسی دقت این تکنیک سعی شده از گونه هایی برای تشخیص استفاده کرد که تشخیص آن ها از طریق روش های معمول مورد استفاده در آزمایشگاه های قارچ شناسی بسیار دشوار باشد.
1-1- بخش اول : کلیاتی در خصوص فئوهایفومایکوزیس و عوامل آن

1-1-1- مقدمه

قارچ های سیاه به صورت گندروی بر روی مواد گیاهی زنده یا مرده ساکن هستند اما بیشتر آنها ساکن خاک می باشند. بیش از 150 گونه و 70 جنس از قارچ های سیاه در بیماری های انسان و حیوان دخالت دارند سندرم های بالینی متنوعی توسط قارچ های سیاه براساس یافته های بافت شناختی ایجاد می شوند که شامل کروموبلاستومایکوزیس،فئوهایفومایستوما و فئوهایفومایکوزیس می باشند.

فئوهایفومایکوزیس به بیماری های ایجاد شده توسط قارچ های تیره از جنس های مختلف اطلاق می شود که شامل: بیماری آلرژیک، عفونت سطحی، عفونت موضعی عمقی، عفونت ریوی،عفونت سیستم عصبی مرکزی و عفونت منتشره میباشند. عفونت سیستم عصبی مرکزی به عنوان فرم کشنده فئوهایفومایکوزیس در افراد با ایمنی سالم به شمار می رود. مهم ترین قارچ های سیاه دارای اهمیت پزشکی، در راسته کتوتریال ها قرار دارند مثل گونه های اگزوفیالا، گونه های کلادوفیالوفورا و گونه های رینوکلادیلا . روش های استاندارد و رایج جهت تشخیص شامل : آزمایش میکروسکوپی مستقیم، رنگ آمیزی های هسیتوپاتولوژی جهت اثبات تهاجم بافتی،یافته های رادیوگرافی و سی تی اسکن می باشد. اخیراً برای تشخیص سریع تر عفونت های قارچی تهاجمی با حساسیت و اختصاصیت بالا ، روش های مولکولی بر پایه PCR توصیه شده است . درمان بسیاری از این عفونت ها با بهره گرفتن از داروهای تری آزول جدید مثل وریکونازول که بیشترین فعالیت in vitro علیه این قارچ ها را دارند انجام می گیرد.

قارچ های تیره یا سیاه به طور گسترده ای در طبیعت پراکنده اند و گاهی می توانند در انسان ایجاد عفونت کنند. این قارچ ها دارای ویرولانس نسبتاً پایینی می باشند و طیف وسیعی از بیماری های را که ایجاد
می کنند به فاکتورهای میزبان وابسته است . عفونت هایی که توسط این قار چ ها ایجاد می شود عبارتند از: فئوهایفومایستوما با گرانول سیاه رنگ، کروموبلاستومایکوزیس، سینوزیت و فئوهایفومایکوزیس های سطحی، جلدی، زیر جلدی و سیستمیک. فئو، یک کلمه یونانی به معنی تیره می باشد و عفونت های حاصل از قارچ های با دیواره تیره را فئوهایفومایکوزیس گویند عبارت های دماتیاسئوس ، فائوئید ، تیره و ملانیزه ، به طور متناوب به جای یکدیگر به کار می روند قارچ های تیره به طور عادی در محیط حضور دارند و اغلب از آزمایشگاه های میکروب شناسی به عنوان آلوده کننده محیط جدا می شوند . در حقیقت فقط 10 درصد از ایزوله های قارچی سیاه در آزمایشگاه با ایزوله های مهم بالینی مشابهند . بیماری های بالینی ایجاد شده توسط این قارچ غیر معمول است و به طور تخمینی در یک شهر بزرگ 1000000/1 مورد در سال می باشد. با وجود این قارچ های تیره به طور فزاینده ای به عنوان پاتوژن های مهم به ویژه در بیماران با ضعف سیستم ایمنی شناخته می شوند، اگر چه در افراد به ظاهر سالم سیستم ایمنی نیز گزارشاتی از عفونت های تهاجمی و اغلب کشنده در دست است، سندرم های بالینی که توسط این قارچ ها ایجاد شده است از طریق یافته های بافت شناختی در فئوهایفومایستوما، کروموبلاستومایکوزیس و فئوهایفومایکوزیس تمایز داده می شوند. فئوهایفومایکوزیس عبارت کلی است که برای سندرم های بالینی ایجاد شده توسط قارچ های تیره به کار رفته است .

قارچ های سیاه یا تیره به طور متناوب به صورت گندروی بر روی مواد آلی در حال فساد یا مواد گیاهی زنده یا مرده ساکن هستند اما بیشتر آن ها ساکن خاک می باشند. شناسایی عوامل اتیولوژیک که باعث ایجاد بیماری در انسان و حیوان می شوند طبق روش های سنتی از طریق ویژگی های فنوتیپیک ایزوله های جدا شده ا ز کشت می باشد. اخیراً ، بیشتر روش های مولکولی برای تقسیم بندی از نظر فیلوژنی و تاکسونومی این قارچ ها به کار گرفته شده است و این باعث می شود که تحقیقات بر روی آن ها آسانتر صورت گیرد. تشخیص فنوتیپیک قارچ های سیاه براساس روش های ریخت شناسی ما کروسکوپی )رنگ کلنی، میزان رشد و مشخصه رشد روی محیط استاندارد) و ریخت شناسی میکروسکوپی (هایفا، سلول های کونیدی زا و کونیدی غیرجنسی و … ) و همچنین تعدادی ویژگی های فیزیولوژیک انجام می گیرد. این روش ها جهت شناسایی قارچ در حد جنس برای ما کاربرد دارد.(1،2،4)

1-1-1-1-مشخصات ریز بینی

ساختمان های مختلفی که در ریزبینی این قارچ ها وجود دارد به خاصیت چند شکل بودن آن ها برمی گردد . بعضی از این قارچ ها ممکن است که در ابتدای رشد به فرم شبه مخمری سیاه باشند اما در ادامه به فرم رشته ای رشد می کنند این خصوصیت بیشتر در اگزوفیالا و جنس های وابسته به آن دیده می شود اکثر قارچ های سیاه بالینی، آسکومایست های هتروتالیک می باشند. روش های کونیدی زایی به صورت های بلاستیک )تولید بلاستوکنیدی های قهوه ای رنگ) که دراکثر جنس ها دیده می شود و یا تالیک که تشکیل شده از هایفایی که از قبل وجود دارد و یا آرتروکونیدی ها مثل نئوسیتالیدیوم می باشد. سلول های کونیدیزای نوع بلاستیک(انتروبلاستیک(به دو صورت آنلیدیک مثل هورتا و اگزوفیالا و فیالیدیک مثل فیالوفورا (در بسیاری از جنس ها) می باشند . این ویژگی های مورفولوژیک بیشتر برای شناسایی گونه های آنامورف استفاده می شود در حالی که برای تلئومورف نمی توان از این طریق جایگاه فیلوژنی تعیین کرد .(2،4،6)