در این پژوهش اثر آغازگرهای لاکتیکی، لاکتوباسیلوس دلبروکی زیر گونه بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس بر روی تغییرات غلظت آفلاتوکسین M1 که در دو غلظت 05/0و1/0 مایکروگرم بر لیتر که به طور مصنوعی به شیر بازساخته در دمای 42 درجه سانتی گراد اضافه شده بود و در طی زمان تخمیر ماست و 21 روز نگهداری دوغ در یخچال، بررسی شد.محاسبه غلظت آفلاتوکسین M1 به وسیله کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا مورد بررسی قرار گرفت. شاخص های pH ، اسیدیته قابل تیتر، غلظت آفلاتوکسین وتعداد باکتری ها اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که آغازگرهای ماست تاثیر بسزایی در کاهش غلظت آفلاتوکسین داشتند. در صد کاهش غلظت آفلاتوکسین M1 در دوغ05/0 مایکروگرم بر لیتر در انتهای زمان تخمیر21% و در انتهای 21 روز نگهداری دوغ 32% بود و در دوغ 1/0 مایکروگرم بر لیتر درانتهای زمان تخمیر23% و در انتهای 21 روزنگهداری دوغ 5/34% بود. در نمونه های که دارای غلظت آفلاتوکسین بیشتری بودند کاهش رشد استرپتوکوکوس ترموفیلوس را به طور معنی داری(01/0 p< )شاهد بودیم.

لغات کلیدی:آفلاتوکسین M1 ، مایکوتوکسین، باکتری های آغاز گر ماست، زمان نگهداری، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا.

1-1- مقدمه

شیر و فرآورده های تخمیری آن، با داشتن ویژگی های تغذیه ای و تکنولوژیکی خاص، به عنوان حاملان باکتری های اسید لاکتیک، امروزه هدف تحقیق و توجه بسیار واقع شده اند. شیر، علاوه بر ایجاد محیطی مناسب جهت رشد و بقاء این باکتری ها، با داشتن خواص تغذیه ای ویژه خود، فرآورده ای با ارزش را به مصرف کننده عرضه می‌کند. از آنجا که شیر و فرآورده های تخمیری آن، از زمان های دور به عنوان ناقلین باکتری های مورد پذیرش بشر بوده اند، کاربرد آنها به عنوان حامل باکتری های پروبیوتیک چندان دور از ذهن نبود و قرار گرفتن این باکتری ها در این پایه، مقبولیت مصرف آن ها را برای مصرف کننده بهبود خواهد بخشید(خسروی دارانی و کوشکی.،شاه،2004.،هارلاک،2002).

مایکوتوکسین ها متابولیت های ثانوی هستند که به وسیله گونه های قارچی تولید شده و بر روی انسان ،حیوانات و میکروارگانیسم ها اثر سمی دارند. تاکنون در حدود هزار نوع از مایکوتوکسین ها شناخته شده اند که حدود 30 تا 40 نوع از آن ها از نظر فرمول شیمیایی شناسایی وسمیت آن ها به اثبات رسیده است. از میان مایکوتوکسین ها ،آفلاتوکسین ها به خاطر اثرات بالقوه سرطان زایی،ناقص الخلقه زایی و جهش زایی اهمیّت بیشتری دارند و در ایجاد سرطان کبد، هپاتیت مزمن و سیروز کبد مؤثرند. آفلاتوکسین M1 از مشتقات 4- هیدروکسی آفلاتوکسین B1 می‌باشد که در شیر PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)دارانی که خوراک حاوی آفلاتوکسین B1 را مصرف می‌‌کنند، دفع می‌شود (آدامز و موس،2000).

آفلاتوکسین ها اغلب در محصولات کشاورزی پیش از برداشت آنها تولید می‌شوند. بعد از برداشت محصول نیز چنانچه خشک کردن آن به تأخیر بیافتد و یا درطی نگهداری در انبار، رطوبت از حد بحرانی تجاوز کند، شرایط برای رشد قارچ های مولد توکسین آماده شده و آلودگی اتفاق می‌‌افتد. آفلاتوکسین ها در انواع مختلف مواد غذایی و محصولات کشاورزی از جمله شیر، پنیر، ذرت، بادام زمینی، پنبه، گردو، فندق، بادام و انجیر شناسایی شده اند. این ترکیبات ممکن است در گوشت طیور و دام هایی که با غذای آلوده به آفلاتوکسین ها تغذیه شده اند نیز ظاهر شوند. ذرت، بادام زمینی و پنبه از محصولاتی هستند که بسیار مستعد آلودگی به آفلاتوکسین‌ها می‌‌باشند(کریم و همکاران،1378).

وجود ذرت و کنجاله پنبه آلوده به آفلاتوکسین در جیره گاو های شیری باعث آلودگی شیر و محصولات لبنی به آفلاتوکسین M1 می‌شود. هضم غذای آلوده به آفلاتوکسین در حیوانات منجر به دفع آفلاتوکسین M1 در شیر در طی 12 تا 24 ساعت می‌شود. لازم به ذکر است که فقط 2/2- 4/0 درصد از آفلاتوکسین B1 به صورت آفلاتوکسین M1 در سطح 07/0-02/0 میکروگرم در لیتر شیر می‌شود. مقدار آفلاتوکسین M1 و سمیت آن در شیر پس از پاستوریزاسیون شیر تغییر محسوسی پیدا نمی‌کند. از آنجایی که آفلاتوکسین M1 محلول در آب است، بنابراین با جدا کردن چربی غلظت آن در شیر افزایش می‌یابد. در جریان خامه گیری و جدا کردن چربی فقط 10و2 درصد از آفلاتوکسین M1 موجود در شیر اولیه به ترتیب به خامه و کره راه می‌یابند(اِلمر و جیمز،2001). دوغ یکی از فرآورده های تخمیری شیر است که می‌توان از ماست، آب کره و یا آب پنیر تهیه کرد. دوغ تهیه شده در این کارخانه از ماست می‌باشد و به دو نوع گازدار و بدون گاز است(حصاری و منافی،1389). در این تحقیق امکان اتصال آفلاتوکسینM1 به باکتری های لاکتیکی در دوغ بدون چربی مورد بررسی و آزمایش قرار گرفته است.

1 -2- ارائه مسأله پژوهش و بیان هدف:

1-2-1- مسأله پژوهش:

       آیا امکان اتصال آفلاتوکسین 1M به باکتری های لاکتیکی در دوغ بدون چربی وجود دارد؟

1-3- اهداف تحقیق:

1-3-1- هدف کلی تحقیق:

دستیابی به روشی سالم و بدون ضرر جهت حذف سم آفلاتوکسین در فرآورده تخمیری شیر كه از نظر تغذیه(انسان) هیچگونه خطری نداشته باشد.

1-4- فرضیه ها:

فرضیه های این تحقیق شامل موارد زیر است:

الف. باکتری های لاکتیکی می‌توانند در مقادیرمختلف آفلاتوکسین تأثیر بگذارند.

ب. میزان مقادیرمختلف آفلاتوکسین می‌تواند بر باکتری های لاکتیکی تأثیر بگذارد.

پ. زمان های مختلف نگهداری در مقادیر مختلف آفلاتوکسین تأثیر معنی دار دارد.

1-5- فاکتورهای مؤثر بر فعالیت ضدقارچی باکتری های اسید لاکتیک

1-5-1- درجه حرارت و زمان گرمخانه گذاری

ردی و همکاران(1985) گزارش کردند که بیشترین تولید متابولیت های ضدقارچی بوسیله لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه دی استی لاکتیس بعد از سه تا چهار روز گرمخانه گذاری اتفاق افتاد. ماکزیمم بازدهی ترکیبات ضدمیکروبی در دمای 25 درجه سانتی گراد بوسیله باکتری لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه دی استی لاکتیس S1-67- C بدست آمد(ردی و رانگاناتان،1985).

مطالعات انجام شده بوسیله سات و همکاران(2007) تشریح نمود که فعالیت ضد قارچی لاکتوباسیلوس پلانتاروم CUK501 در دمای 30 درجه سانتی گراد زمانی که کشت در انتهای فاز لگاریتمی بود، در حد ماکزیمم (1280 AU/ml) بدست آمد(ساته و همکاران،2007).    

1-5-2- اثر محیط رشد

در رابطه با اثر محیط رشد بر روی تولید متابولیت های ضدقارچی بوسیله باکتری های اسید لاکتیک گزارشات کمی در دست است. تحقیقات نشان داده است که بهترین محیط برای تولید ترکیبات ضدقارچی بوسیله لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه لاکتیس CHD 28.3 بر علیه آسپرژیلوس فلاووس IARI در مقایسه با محیط های MRS و M17 می‌باشد(روی و همکاران،1996). در هرحال، در محیط کشت شیر، لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه دی استی لاکتیس میزان کمی ترکیبات ضد قارچی در مقایسه با آسپرژیلوس فومیگاتوس که قابل شناسایی با روش پراکنش(توزیع) آگار نیست،تولید می‌کند(باتیش و همکاران،1990).

1-5-3- اثر فاکتورهای تغذیه ای

ایفات و همکاران(2001) اثر فاکتورهای ضد تغذیه ای را بر روی تولید متابولیت های ضدقارچی بوسیله لاکتوباسیلوس رامنوزوس بررسی کردند و نشان داده شد که عصاره مخمر و گلوکز همانند کلرید سدیم و کلرید کلسیم تولید مواد ضدقارچی را کنترل می‌کنند(عفت و همکاران،2001). افزودن تا 2 درصدگلوکز به افزایش تولید متابولیت های ضد قارچی بوسیله لاکتوباسیلوس رامنوزوس منجر شد(دالی و همکاران،2010).

1-5-4- اثر pH

شرایطpH  بطور مؤثری موجب کنترل تولید متابولیت های ضد قارچی بوسیله باکتری های اسید لاکتیک می‌گردد(ساته و همکاران،2007). لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه دی استی لاکتیس قادر به تولید مقادیر معنی داری از مواد ضدقارچی در محدوده

 نزدیک pH=5.5-7 است ، اگرچه ماکزیمم تولید در pH=6.8 گزارش شده است(باتیش و همکاران،1997).

1-6- شرایط عمومی و رشد لاکتوباسیل ها

گونه های لاکتوباسیل ها قادر به هیدرولیز ژلاتین و کازئین نبوده و نیز اندول و H2S ایجاد نمی‌کنند و درموارد خاص احیا کننده نیترات می‌باشند. تولید رنگدانه در آن ها نادر است. لاکتوباسیل ها در pH حدود 4/5 رشد خوبی دارند، اما تا pH حدود 2 نیز قادر به رشد بوده به این دلیل، اصطلاحاً آنها را باکتری های تحمل کننده اسید می‌نامند. بسیاری از منوساکارید ها را به کمک پِرمئازهای خود جذب کرده و در داخل یاخته های خود هیدرولیز می‌کنند. رشد سطحی آنها در محیط های جامد ، به طور عمده در شرایط بی هوازی و یا کاهش فشار اکسیژن موجود و حضور 5 تا 10 درصد دی اکسید کربن افزایش می‌یابد. محدوده دمایی رشد آنها بین 30 تا 52 درجه سانتی گراد و دمای بهینه آنها بین 30 تا 40 درجه سانتی گراد می‌باشد(آدامز،1988.،سروویسکا و همکاران،2002).

1-6-1- اثرات پروبیوتیک باکتریها در محصولات لبنی

کلمه پروبیوتیک از یک لغت یونانی به معنای حیات بخش گرفته شده است . استیل ول برای اولین بار کلمه ی پروبیوتیک را برای توصیف مواد ترشحی از یک موجود تک یاخته که رشد موجود دیگری را تحریک می‌نمود ، بکار برد . هاونار پروبیوتیکها را به عنوان یک کشت منفرد یا مخلوطی از M . O  ها تعریف نمود که زمانی که توسط انسان یا حیوان مصرف می‌شوند با بهبود ویژگی های میکروفلور داخلی ، اثرات مفیدی را در میزبان بجای می‌گذارند(سالمینن و همکاران، 2010).

لاکتوباسیلوسها مهم ترین باکتری های پروبایوتیک انسانی هستند که برای انسان کاملاٌ ایمن وغیر بیماری زا هستند.اضافه کردن این باکتریها به شیر باعث افزایش اثر سلامت بخشی شیر و محصولات لبنی حاصل از آن و تقویت فلور میکروبی روده انسان میشود. نقش محافظتی پروبیوتیك‌ها بر علیه بیماریزاهای روده و مكانیسم تأثیر آنها جهت انتخاب سویه‌های جدید برای مصارف انسانی، در سالهای اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است. مكانیسم اثرات سودمند پروبیوتیك‌ها بر روی میزبان چندان شناخته نشده است. از مكانیسم‌های شناخته شده می‌توان به كاهش pH روده، رقابت با بیماریزاها جهت اتصال به گیرنده‌ها و منابع غذایی، ترشح تركیبات ضد میكروبی، غیرفعال سازی توكسین‌ها و تقویت سیستم ایمنی اشاره كرد. با پیشرفت سریع علم در رابطه با رفتار باكتریهای پروبیوتیک و باكتری‌های موجود در سطح روده انسان، امكان استفاده از تركیب گونه‌های مختلف پروبیوتیک جهت بهبود تأثیر آنها نسبت به یک نوع پروبیوتیک فراهم شده است. به دلیل پیچیدگی فلور میكروبی روده، تركیب پروبیوتیك‌ها جهت تأثیر بر قسمت‌های مختلف دستگاه گوارش لازم می‌باشد و ممكن است اثرات سلامتی بخش بر میزبان را افزایش دهد. ابتدا در صورت انتخاب گونه‌های نامناسب پروبیوتیك‌ها، ممكن است تركیب آنها بی‌اثر باشد. گزارشات اندكی در رابطه با تركیب پروبیوتیك‌ها و اثرات سلامتی بخش آنها در محیط طبیعی موجود می‌باشد.

1-6-2- ویژگی های سویه های پروبیوتیکی

معیارهای اصلی جهت انتخاب سویه های پروبیوتیکی برای مصارف غذایی انسان عبارتند از :

• منشا انسانی داشته باشند .
• بیماری زا نباشند .
• در برابر اسید معده و محیط صفراوی مقاوم باشند .
• قادر به تحمل فرایندهای تکنولوژیکی بوده و در طی دوره ماندگاری محصول زنده باقی بمانند .
• در برابر آنتی بیوتیکهای متداول مورد استفاده در مواد غذایی مقاوم باشند .
• توانایی انتقال مواد ژنتیکی مانند فاکتورهای مقاومت را به میکروارگانیزم های بیماریزا نداشته باشند .
• در طی عبور از دستگاه گوارش زنده مانده و توانایی چسبیدن به دیواره ی روده را داشته باشند.
• با تولید مواد ضد میکروبی اثر پادزیستی در برابر میکروبهای بیماریزا داشته باشند .
• اثرات مفید و سودبخش آنها بر سلامتی انسان سندیت داشته باشد.

1-6-3- مواد مورد نیاز لاکتوباسیل ها

لاکتوباسیل ها ، برای رشد به برخی اسیدهای آمینه ، پپتیدها ، اسیدهای نوکلئیک ، ویتامین ها نمک ها ، اسیدهای چرب ، استرهای اسیدهای چرب و کربوهیدرات های قابل تخمیر نیاز دارند. نیازهای غذایی عموماً برای گونه های مختلف متفاوت بوده و اغلب برای هرگونه اختصاصی است. به عبارت دیگر لاکتوباسیل ها فقط در محیط های حاوی مواد آلی پیچیده، قادر به رشد هستند و حضور اسید پانتوتنیک و اسید نیکوتنیک برای آنها الزامی است، در حالی که تیامین فقط برای رشد لاکتوباسیل های هتروفرمنتانیو ضروری می‌باشد. به علاوه اسیدفولیک، ریبوفلاوین، پیریدوکسال فسفات و پاراآمینوبنزوئیک نیز برای رشد برخی از گونه الزامی است(تسینک و همکاران،2005).

بیوتین و ویتامین B12 ، فقط برای رشد تعدادی از این باکتری ها لازم است. مطالعه روش های وابسته به ویتامین معمولاً برای ارزیابی حیاتی این باکتری ها به کار می‌رود. بسیاری از نیازهای رشد لاکتوباسیل ها به علت وجود تعدادی نقص در ژنوم آنهاست(مرتضوی و همکاران،1386).

در حالت طبیعی نیاز به مواد غذایی ضروری این باکتری ها با افزودن کربوهیدرات های قابل تخمیر ، مانند پپتون ، گوشت و عصاره مخمر بر طرف می‌شود. ترکیبات منگنز ، استات و توئین ـ80 ،محرک رشد هستند و در اکثر اوقات برای رشد بیشتر گونه های آنها ضروری است(رویز و هماران،1994).

1-7- قارچ آسپرژیلوس

قارچ آسپرژیلوس از سلسله آسکومیست ها،گروه پلکتومیست ها و در راسته یوروشیال ها قرار دارد. کنیدیوفر آسپرژیلوس ، عمودی و بدون انشعاب بوده و در قسمت انتهایی متورم شده و به یک سر کروی تبدیل می‌شود. در این دسته از قارچ ها فیالید دارای ساختمان ویژه ای است به طوری که در قسمت وسط پهن تر و در نوک باریک تر می‌شود. کنیدی از قسمت انتهایی فیالید جوانه می‌زند، اما به وسیله دیواره جدا نمی‌شود تا اینکه کامل رشد نماید(تجلی و همکاران،1390). پس از آن کنیدی دیگری رشد وتوسعه می‌یابد. به این ترتیب یک ردیف کنیدی شکل گرفته و همگی در یک سطح ایجاد می‌شوند.کنیدی ها خشک هستند و به آسانی به وسیله باد جدا می‌گردند. آسپرژیلوس ها جزء قارچ های ساپروفیت می‌باشند. در طبیعت گستردگی زیادی دارند و تعدادی از‌آن ها باعث فساد مواد غذایی می‌شوند. بعضی از انواع آسپرژیلوس ها در فراوی مواد غذایی به کار می‌روند(اینگولد و هادسون،1997).

1-8- آفلاتوکسین ها

مایکوتوکسین ها متابولیت های ثانوی هستند که به وسیله گونه های قارچی تولید شده و بر روی انسان ،حیوانات و میکروارگانیسم ها اثر سمی دارند. تاکنون در حدود هزار نوع از مایکوتوکسین ها شناخته شده اند که حدود 30 تا 40 نوع از آن ها از نظر فرمول شیمیایی شناسایی و سمیت آن ها به اثبات رسیده است. از میان مایکوتوکسین ها ،آفلاتوکسین ها به خاطر اثرات بالقوه سرطان زایی ، ناقص الخلقه زایی و جهش زایی اهمیّت بیشتری دارند و در ایجاد سرطان کبد ، هپاتیت مزمن و سیروز کبد مؤثرند. سه گونه آسپرژیلوس به نام های آسپرژیلوس فلاووس ، آسپرژیلوس پارازیتیکوس ، و گونه هایی از آسپرژیلوس نومیوس قادر به تولید آفلاتوکسین ها می‌باشند. آسپرژیلوس فلاووس آفلاتوکسین را ایجاد می‌کند، در حالی که دو گونه دیگر هر نوع آفلاتوکسین BوG را تولید می‌نمایند(تجلی و همکاران،1390) .