گونه های قارچ پنی سیلیوم به واسطه تولید آنتی بیوتیک پنی سیلین، مایکوتوکسین و آنزیم به ویژه پکتیناز و اسید فولیک در مصارف بیوتکنولوژیک متعدد مانند پزشکی، کشاورزی و صنایع غذایی و موارد دیگر کاربردهای گوناگونی دارد.

آنتی بیوتیک پنی سیلین تا کنون جان میلیون ها انسان را نجات داد. قارچ پنی سیلیوم با تعداد قریب 200 گونه یکی از بزرگترین قارچ های خاکزاد و هوازاد است.

در این تحقیق استخراج قارچ ها از خاک های مورد مطالعه از روش سوسپانسیون انجام شد. 1 میلی لیتر از سوسپانسیون نهایی به پتری های حاوی آگار، رزبنگال و استرپتومایسین اضافه گردید. پس از 7-5 روز کلنی های پنی سیلیوم شناسایی و به لوله های حاوی PDA منتقل گردید.

جدایه های باکتری ها روی محیط NA تهیه مایه تلقیح آنها با جدایه های پنی سیلیوم تلقیح شدند. شفافیت و کدورت نمونه ها با نمونه شاهد مورد مقایسه قرار گرفت.

یک قرص از توده میسلیومی از محیط کشت شفاف انتخاب و به محیط PDB جهت تهیه توده میسلیومی منتقل گردید. توده میسلیومی در هاون حاوی ازت پودر گردید، پودرها حاوی ویال‌های 5/1 میلی لیتری گردید 600 میکرو لیتر بافر CTAB و 1 میکرولیتر مرکاپتانول اضافه گردید. ویال ها وارد بن ماری شدند. با افزودن کلروفرم – ایزو آمیل الکل سانتریفوژ انجام شده رسوب DNA با اتانول 70 ٪ شستشو داده بافر TE اضافه شد.

تعیین غلظت و خلوص نسبی به دو روش ژل آگارز 8/0٪ و نیز با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر انجام شد. DNA بدست آمده پس از ارزیابی جهت تکثیر نواحی ریبوزومی مورد استفاه قرار گرفت. محصول PCR جدایه ها، جهت تعیین توالی به شرکت BIONEER کره ارسال گردید.

شناسایی مولکولی جدایه ها در پایگاه اطلاعات NCBI با بهره گرفتن از Blast انجام وبر اساس توالی های معتبر موجود در بانک بر اساس بالاترین میزان شباهت به دست آمده است.

در بررسی مولکولی بیش از 50 جدایه از 80 جدایه، منجر به شناسایی گونه های ذیل گردید.

Penicillium aculeatum, P.aurantiogriseum, P.chrysogenum, P.citrinum,

P.commune, P.crustosum, P.griseofulvum, P.pinophilum, P.simplicissimum

در بررسی های قابلیت های آنتی باکتریال جدایه ها، کلیه جدایه ها در تقابل با شش گونه باکتری بیماری زای گیاهی به طور همزمان کشت داده شدند و بر اساس نتایج به دست آمده غالب جدایه ها فعالیت ضد باکتریایی داشته و از رشد باکتری ها ممانعت کردند.

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                                     صفحه

فصل اول

مقدمه ………………………………………………………………………………………………………. 6

فصل دوم: بررسی منابع

2-1-محیط خاک ………………………………………………………………………………………………………………….. 9

2-2-بیواکولوژی Bioecology ………………………………………………………………………………………… 9

2-3-بخش زنده خاک ………………………………………………………………………………………………………….. 9

2-4-رده بندی وال ورک (Wallwork) ………………………………………………………………………….. 12

2-5-ماکروارگانیسم های خاک ……………………………………………………………………………………………. 12

2-6- میکروارگانیسم های خاک ………………………………………………………………………………………….. 13

2-7- شاخه نماتدها ……………………………………………………………………………………………………………… 14

2-8- فلور میکروبی خاک …………………………………………………………………………………………………….. 15

2-9- اکتینومیست های مهم و فراوان در خاک ………………………………………………………………… 18

2-10- جلبک ها (Algae) ………………………………………………………………………………………………… 18

2-11- تعامل میکروارگانیسم های خاک با یکدیگر …………………………………………………………… 19

2-12- کنترل بیولوژیک ………………………………………………………………………………………………………. 21

2-13- باکتری ها و خاک ……………………………………………………………………………………………………. 25

2-14- ارزیابی فعالیت آنتی باکتریال پنی سیلیوم ها ……………………………………………………….. 26

2-15- پنی سیلیوم ها …………………………………………………………………………………………………………. 28

2-16- فعالیت های بیولوژیک پنی سیلیوم ها …………………………………………………………………… 29

2-17- تنوع ژنتیکی …………………………………………………………………………………………………………….. 31

2-18- مطالعات مولکولی قارچها …………………………………………………………………………………………. 34

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1-استخراج قارچ های خاک ……………………………………………………………………………………………. 41

3-2-جدایه های باکتریایی …………………………………………………………………………………………………… 42

3-3-ارزیابی تولید مواد بازدارنده رشد باکتریها ………………………………………………………………….. 42

3-4- استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………………… 42

نتایج ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 48

نتایج شناسایی گونه ها …………………………………………………………………………………………………………. 59

بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 68

Abstract ……………………………………………………………………………………………………………………………. 78

منابع و مآخذ …………………………………………………………………………………………………………………………. 79

 مقدمه

مطالعات بیولوژی خاک شامل باکتری ها، جانوران، آغازیان و قارچ ها خاک است. از آنجا که بررسی‌های مربوط به فعالیت های بیولوژیک خاک ها و بویژه خاک های زراعی با شناسائی موجودات هر یک از زیر مجموعه های زنده خاک شروع می شود، تحقیقات مربوط به قارچ های خاک نیز نیازمند شناسائی فلور آنها است. جنبه های مختلف فعالیت قارچ های خاک در حاصلخیزی خاک های زراعی تأثیر مستقیم و غیر مستقیم داشته و غالب آنها در شرایط آزمایشگاهی قابل پیگیری می‌باشند. از موارد قابل مطالعه در محیط آزمایشگاهی به توانائی جنس ها و گونه های مختلف میکرومیست ها در تجزیه مواد آلی بویژه سلولز و قابل استفاده ساختن عناصر غذائی ماکرو میکرو و آزادسازی آنها از منابع نامحلول موجود در خاک برای گیاه می توان اشاره کرد. از قارچ ها می توان جهت بهبود شرایط باروری خاک ها و رشد و نمو مناسب تر گیاهان در خاک های نامناسب و کم بازده کمک گرفت. بخشی از فلور قارچی خاک به عوامل بیماریزای پارازیت اختیاری و پارازیت اجباری تعلق دارد.

قارچ ها یکی از اجزاء زنده محیط خاک هستند. هر ساله مقادیر متنابهی از بقایای گیاهان زراعی به خاک های مزارع اضافه می شوند که در نتیجه دخالت میکروارگانیسم های خاکزی بویژه قارچ ها تجزیه شده و مواد آلی حاصل از آنها به خاک افزوده می گردد.

قارچ های خاک به گروه های تاکسونومیکی متفاوتی تعلق دارند که فراوانترین آنها اوومیکوتا، زیگومیکوتا دوترومیکوتا را می توان نام برد. مطالعات مربوط به بیولوژی خاک در بخش قارچ ها با شناسائی تاکسونومیک آغاز و امکان پذیر می گردد.

سابقه شناسایی تاکسونومیک قارچهابه زمان آغاز نامگذاری دو اسمی موجودات زنده از زمان لینه برمیگردد. از آن زمان تا به حال مطالعه مرفولوژیک قارچها تکامل زیادی یافته و با تکنیکهای نوین بویژه روش های مولکولی تلفیق گردیده است . تاجایی که امروزه با معرفی و تکمیل شناساگر های مولکولی و تعیین توالی قطعات مختلف ژنومی در حال تحول اساسی و کنار گذاشتن روش های مرفولوژیک است .

در این تحقیق سعی شده تا یکی از فراوانترین قارچهای خاکزاد مورد بررسی تاکسونومیک مولکولی قرارگرفته و از مجموع فعالیتهای بی شمار آن ها در محیط خاک ، در شرایط آزمایشگاهی یکی از مهمترین آنها مورد مطالعه قرارگیرد.

2-1 محیط خاک

خاک از مواد معدنی، ریشه گیاهان، موجودات زنده خرد و درشت، مواد آلی در مراحل مختلف تجزیه، آب و هوا تشکیل شده است.

پراکنش غیر یکنواخت این اجزا، شرایط بسیار متنوعی را در مقیاس های مختلفی از حفره های کوچک تا سطح مزرعه ایجاد، و این امر، مطالعه خاک را با مشکل رو به رو می کند. طیف وسیعی از عوامل فیزیکی و شیمیایی که دارای اثر متقابل هستند در تنوع خاک سهیم اند.

2-2 بیواکولوژی Bioecology

مطالعه و شناخت موجودات و همچنین رابطه ای که بین آن ها و محیط اطرافشان وجود دارد می‌باشد. در این علم مطالعه موجودات و ارتباط آن با محیطی که در آن بسر می برند قرار می گیرد.

1-2-2 بیو اکولوژی خاک

مطالعه موجودات زنده خاک، همچنین شرایط محیطی که این موجودات در آن زندگی می‌کنند و تعاملی که بین این موجودات و شرایط محیطی موجود در زیستگاه آنها حاکم است مورد بررسی قرار می گیرد.

2-3 بخش زنده خاک

موجودات زنده خاک به دو گروه تقسیم می شوند

-3-1 فلور که در لاتین (flora) نامیده می شود شامل قارچ ها، باکتریها ، اکتینومیست ها ، جلبک ها ، ویروس ها ، و گیاهان می باشند.

2-3-2 فون که در لاتین به نام (Fauna) نامیده می شود که به سه گروه بنام های ماکروفون، مزوفون و میکروفون تقسیم شده است که شامل جانوران می باشد.

2-3-3 بر اساس درشتی و ابعاد‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍،‍‍‍‍ موجودات زنده را به دو گروه ماکرو ارگانیسم و میکروارگانیسم و میکروارگانیسم ها را به 5 سلسله از لحاظ رده بندی یا تاکسونومی بنام های مونرا (Monera) یا پروکاریوت ها، پروتیست ها (Protista) یا موجودات تک سلولی (آغازیان)، حیوانات (Animalia)، قارچ ها (Fungi) و گیاهان (Planta ) تقسیم کرده اند.

هر تغییری که در اکوسیستم خاک حادث شود ممکن است جمعیت موجودات زنده خاک اعم از فون و فلور را تحت تاثیر قرار دهد و نیز موجودات زنده خاک موجب تغییرات فیزیکی و شیمیایی خاک می شود و به همین دلیل در دراز مدت خواص شیمیایی و فیزیکی خاک تحت تاثیر موجودات زنده داخل خاک تغییر می کند. این تغییر در روی موجودات زنده داخل خاک اثر گذاشته و جمعیت آنها به تعادل دینامیک می رسند.

2-3-4 انواع موجودات زنده خاک بر اساس اندازه

2-3-4-5 ماکرو ارگانیسم ها (Macro-organisms) با چشم غیر مسلح قابل مشاهده هستند.

2-3-4-6 میکروارگانیسم ها (Micro-organisms) با چشم میکروسکوپ قابل مشاهده هستند.

2-3-4-6 افراد هر یک از دو گروه، بر حسب منشاء گیاهی یا حیوانی که دارند به دو دسته متمایز تفکیک می شوند.

2-3-4-7 جانوران یا فون (Fauna)

2-3-4-8 گیاهان یا فلورا (Flora)

2-3-4-9 جانوران میکروسکوپی یا میکروفون (Micro fauna)

2-3-4-10 گیاهان میکروسکوپی یا میکروفلور (Micro flora)

2-3-4-11 جانوران ماکروسکوپی خاک

1-میکروفون: اندازه بدن این جانوران بطور متوسط کمتر از 2/0 میلی متر است مانند پروتوزوئرها.

2-3-4-12 مزوفون (Mesofauna) یا میوفون (Meiofauna): شامل جانورانی با اندازه متوسط 2/0 تا 4 میلی متر است. مانند پادمان و کنه ها، بی شاخکان و دم چنگالان

2-3-4-13 ماکروفون (Macro fauna): شامل جانورانی با اندازه متوسط 4 تا 80 میلی متر است مانند کرم خاکی و انواع حشرات بالدار و هزارپایان و عنکبوتیان و نرم تنان

2-3-4-14مگافون (Mega fauna): شامل انواع جانوران کاملا درشت به اندازه متوسط 80 میلی متر تا 6/1 متر مانند بعضی خزندگان، بعضی موش ها و بعضی از خرچنگ ها .

2-4 رده بندی وال ورک (Wallwork): جانوران خاک را به سه گروه به اسامی میکروفون (انواعی به اندازه 20 تا 200 میکرون)، مزوفون (جانورانی به طول 200 میکرون تا 1 سانتی متر) و ماکروفون (شامل انواعی به طول بیش از 1 سانتی متر) تقسیم کرده است[16].

2-5 ماکروارگانیسم های خاک

2-5-1 شاخه کرم های حلقوی یا آنیلیدا (Phylum Annelida): از رده الیگوکتا (Oligochaeta) تحت نام کرمهای خاکی و خانواده آنکی ترئیده (Enchytraeidae)